【一问一答，通俗易懂】十问抽个血为什么就能查出早期肺癌

肺癌是世界上主要的癌症死因，约占高达27%的全肿瘤相关死亡。2015年肺癌已超越前列腺癌成为男性最常诊断的第一大癌症类型，在女性则为最常诊断的第二大癌症类型，仅次于乳腺癌。肺癌分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，发病率最高的还是非小细胞肺癌，约占所有肺癌的80～85%。但是，肺癌在诊断之时大多数都是局部晚期肺癌或者是转移性肺癌了。

早期非小细胞肺癌的标准治疗方案是手术，随后就是铂类药化疗，近年来靶向治疗药也开始进入个体化的一线治疗行列。然而，这些患者在诊断为肺癌的5年内有30%～80%的患者死亡。2007年，研究显示I期肺癌的5年生存率为50%，而IV期肺癌的生存率低于5%。由此可见，临床医疗过程中对早期非小细胞肺癌的肿瘤负荷、最小残余病灶和肿瘤异质性的监测都可能会起到一定的改善作用。

多年前，我们在设想：若能抽个血就能检查出早期肺癌，这是多么好的一个事情啊！当年这是一个科幻梦，然而，随着医学技术的进步和大量医学科研人员的不断努力，这一愿望今天终于得以实现。它就是今天我们要谈到的细胞外循环游离DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA），也称为循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），可被视为“液体活检（Liquid Biopsy）”。目前，这三种名字处于混用的阶段，但都是指同一桩事情。

其实，这个故事早在50多年前就开始。1965年，Bendich等学者在《科学（Science）》上发表了《循环DNA可作为一种肿瘤形成过程中的可能因子》。1977年，Leon等学者又在《癌症研究（Cancer Research）》杂志上发表了《癌症患者血清中的游离DNA与治疗效果》。2011年，Schwarzenbach等学者在《自然评论：癌症（Nature Reviews Cancer）》杂志上发表了《游离核酸作为癌症患者的生物标记物》一文，该文的发表使循环游离DNA得到了广泛地认识和大力的推广。在《麻省理工学院技术评论（MITTechnologyReview）》杂志将“液体活检技术”评为2015年度十大突破技术之一，从而向世人展示了循环肿瘤DNA的发展潜力和应用前景。

今天，我好大夫周俊医生就以常用的十问十答形式来来浅谈一下循环肿瘤DNA的相关问题，希望能给大家一些帮助。

注意：本文定义的早期肺癌是指I-IIIA期非小细胞肺癌。本文只关注循环游离DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），不讨论循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）。

AJCC第7版肺癌分期可见《【一问一答，通俗易懂】十问小细胞肺癌（一）》Q2第二问。

2017年1月推荐使用的AJCC第8版肺癌分期，其中IA期肺癌可见《【一问一答，通俗易懂】十问PETCT+HRCT预测GGN》Q3第三问。

Q1:什么是血液中的循环肿瘤DNA（ctDNA）？它有什么临床意义？

A1:循环肿瘤DNA（ctDNA）是指肿瘤细胞坏死或凋亡后释放入人体血中不断循环的含有肿瘤基因组的细胞外游离DNA。

循环游离DNA（cfDNA）与循环肿瘤DNA（ctDNA）的不同之处在于，前者不仅指循环肿瘤DNA，还包括反应自主免疫性疾病和创伤等临床疾病的循环游离DNA。

循环肿瘤DNA（ctDNA）上有肿瘤的病理学特征，如基因突变和表观遗传学改变等。多项研究表明ctDNA检测的基因突变与肿瘤组织上的发现一致。因此，对它的检测才被称为“液体活检”，可以说它明显改善了目前的肿瘤诊断系统，甚至可用于检测早期肺癌，评估早期肺癌的预后以及随访。

Q2:抽血检查循环肿瘤DNA（ctDNA）与肿瘤组织活检有什么差异？

A2:循环肿瘤DNA（ctDNA）是非创伤检查，能更好地体现肿瘤异质性、监测肿瘤进程和靶向治疗的动态，但是该检查方法样本量低、检测分离相对困难。而肿瘤组织活检则样本体积大，还可存档，不过它是创伤性检查，且受肿瘤异质性的影响明显，只能反应及时情况，重复性不佳。

Q3:抽血检查循环肿瘤DNA（ctDNA）的方法有哪些？

A3:检测循环肿瘤DNA（ctDNA）的方法有以下五种：

第一种是实时荧光定量PCR（real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)。它是检测突变以及ctDNA应用最广泛的技术。基于探针的不同可分为Taqman探针（检测极限10%）、Taqman检测突变检查（检测极限0.1%）和蝎子探针。在肺癌研究中，大多数都是采用qRT-PCR去检测ctDNA，特别是检测EGFR突变。不过，该检查的灵敏度不足以检测出ctDNA中的所有突变。

第二种是数字PCR（digital PCR）。它与qRT-PCR的最大不同在于定量核酸的程序不一样。qRT-PCR是单样本单反应，而数字PCR是单样本成千倍的复制，每个复制为一个反应，因而后者的技术更灵敏。不过，数字PCR主要的不足在于确定ctDNA有突变和突变量的标准阈值尚未确立。

第三种是磁珠乳液扩增方法（amplification protocols with magnetic beads in oil emulsions（beads emulsion），amplification and magnetics，BEAMing】。它的原理基于流式技术和数字PCR的结合。但是，它是一个复杂的技术，这限制了它的可行性和重复性。

第四种是高通量测序（next-generation sequencing，NGS）。到目前为止，它在临床分子肿瘤学方面具有最高检测灵敏度和特异性。但是，费用昂贵、需要综合分析以及解释结果的专家和存储大量的测序数据的基础设备都是妨碍NGS应用到临床常规检查中的劣势。

第五种是质谱（mass spectrometry，MS）。目前，应用质谱检测突变的主要方法是基质相关镭射解吸电离飞行时间（matrix-assisted laser desorption-ionization-time-of-light，MALDI-TOF）。不过，它不仅耗时长，且相对上述技术更昂贵，更要命的是只给出基因型数据。

Q4:非小细胞肺癌已发现哪几种驱动基因突变？

A4:最著名的是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变，这种突变常见于女性、亚裔和非吸烟的腺癌患者。最常见的EGFR突变是19外显子缺失、21外显子密码子858的精氨酸被亮氨酸取代的点突变（L858R）和18外显子密码子719的甘氨酸被丙氨酸、半胱氨酸或丝氨酸替代（G719X）。

KRAS是丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路的前体，它在肺癌时常发生突变。大约15%～25%的非小细胞肺癌患者会出现KRAS基因突变，并常见于吸烟者和腺癌患者。大多数突变位于第2和第3外显子（G12、G13和Q61）。

第三个就是KRAS下游的一个效应BRAF基因突变，该突变常见于非小细胞肺癌。最常见的BRAF基因突变是胸腺嘧啶转换为腺嘌呤的突变，这直接导致密码子600的缬氨酸被谷氨酰胺替代，从而激活BRAF激酶。BRAF基因突变可见于1～3%的非小细胞肺癌患者。

第四个就是HER2激酶结构域突变者，它最常见于非吸烟者，约占4%的非小细胞肺癌患者。大多数HER2突变是在20外显子插入3到12个碱基对。

Q5:ctDNA在非小细胞肺癌基因突变的研究现状如何？

A5:研究发现在388例手术切除的I期非小细胞肺癌患者的ctDNA检出的EGFR突变与总生存期更长（P=0.005;HR=0.163;95%CI,0.046–0.571）以及无进展生存期更久（P=0.037;HR=0.345;95%CI,0.127–0.940）相关。

好大夫周俊医生目前未见ctDNA应用于检测早期非小细胞肺癌KRAS基因突变的研究。

虽然ctDNA检出BRAF基因突变在多种肿瘤中可见与更低的无进展生存期和总生存期相关。但到目前为止，用ctDNA检出BRAF基因突变研究与非小细胞肺癌患者的临床结局的试验还未见发表。

用ctDNA去检测HER2突变可作为早期非小细胞肺癌的一个预后生物标记物。

Q6：什么是表观遗传学？怎么检测表观遗传学改变？

A6：表观遗传学（Epigenetics）是指在研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，对基因表达或基因表型（表现）进行可遗传性改变的机制研究。

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。可以说，检测表观遗传学改变检测就是DNA的甲基化。

Q7：什么是表观遗传学的DNA甲基化？

A7：表观遗传学的DNA甲基化往往是肿瘤发生过程中一个早期事件，它会引起癌症的启动、进展和对治疗的缓解。

Q8：ctDNA在早期肺癌的表观遗传学的研究现状如何？

A8：由于表观遗传学改变不完全就是一个特异性的肿瘤过程，而是非肿瘤组织甲基化也可出现，并且是年龄相关的。因此，在进行ctDNA检测甲基化是需要选择一个合适的能作为循环生物标记物的基因。

目前，ctDNA可在早期非小细胞肺癌检测异常甲基化的九个基因是：

（1）APC（APC，WNT信号通路调节因子）；

（2）钙粘蛋白13（CDH13）；

（3）激肽释放酶相关肽酶10（KLK10）；

（4）肺癌和食管癌1缺失（DLEC1）；

（5）Ras相关区域家族成员1A（RASSF1A）；

（6）EGF含纤蛋白样细胞外基质蛋白1（EFEMP1）；

（7）分泌型卷曲相关蛋白1（SFRP1）；

（8）维甲酸受体β（RARB）；

（9）细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（CDKN2A）。

目前的研究显示ctDNA在诊断早期非小细胞肺癌的敏感性为83.64%，特异性为74.0%。

Q9：抽血检测ctDNA能监测肿瘤负荷吗？

A9：目前，癌胚抗原（CEA）和癌抗原CA19-9是主要评估非小细胞肺癌的肿瘤负荷的循环生物标记物。但是，这些蛋白也可表达于正常细胞，在良性病变时亦见升高。因此，这些肿瘤标记物的特异性低，需要寻找更好的标记物。

一种新的超敏感定量肿瘤ctDNA的方法叫做肿瘤个体化分析深度测序（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）。该方法可评估I-IV期非小细胞肺癌的多种基因改变。研究显示ctDNA可检测II-IV期中100%的基因突变，I期中50%的基因突变，特异性高达96%，能检测到低至0.02%的ctDNA水平。ctDNA水平与肿瘤体积相关，能提供比影像学方法更早的疗效评估。它能将I-III期非小细胞肺癌手术切除患者与健康人对照组区分开来。在IA期患者中，ctDNA水平有更高的平均值。值得注意的是，ctDNA水平不是对肿瘤负荷的简单测量。2017年4月份权威期刊《核医学杂志》（JNM）发表研究显示在非小细胞肺癌的局部或远处转移水平，ctDNA与肿瘤代谢相关，而与肿瘤代谢容积不相关，这意味着ctDNA能更好地反应肿瘤生物学行为（侵袭性）而不是转移性非小细胞肺癌的肿瘤负荷。

Q10：抽血检测ctDNA能监测最小残余病变吗？

A10：在临床工作中，最主要的预判有最小残余病变的临床和病理标准是恶性肿瘤的TNM分期。TNM分期能帮助临床医生评估患者肿瘤复发的风险和辅助化疗可能的获益，但它不能告知患者是否存在最小残余病变。

然而，ctDNA确是一个术后非常有用的检测残余病变的生物标记物，它可选择可能出现复发的患者并为其提供证据。实际上，ctDNA的检测应该在手术完成后而在辅助治疗开始前，后者常在术后施行6～8周的治疗方案。研究显示术后检测到ctDNA的所有患者肿瘤在1年内复发，而未检测到ctDNA的所有患者则呈无病生存状态。

结语：有鉴于此，好大夫周俊医生认为ctDNA是动态监测肿瘤患者的一个重要方法，它将会是影像学检查的重要补充，能为肺癌术后患者的随访提供无价的信息。

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参考资料：

[1]Pérez-Ramírez C,et al.Liquid biopsy in early stage lung cancer.Transl Lung Cancer Res 2016;5(5):517-524.

[2]Morbelli S,et al.J Nucl Med.2017 Apr 27.pii:jnumed.117.193201.doi:10.2967/jnumed.117.193201.[Epub ahead of print]