Nat Neurosci ：帕金森病研究新突破：细胞模型揭示病理机制

“Modeling Parkinson’s disease pathology in human dopaminergic neurons by sequential exposure to α-synuclein fibrils and proinflammatory cytokines”

通过对诱导多能干细胞（iPSC）衍生的人类多巴胺能（DA）神经元进行 α- 突触核蛋白原纤维（PFFs）和促炎细胞因子的顺序处理，建立了一种帕金森病（PD）病理的细胞模型。研究发现，这种双重处理会导致类似路易小体（LB）的包涵体形成，且该过程与免疫触发的溶酶体功能障碍有关。

PD 病理与研究现状：路易小体（LBs）是 PD 的标志性病理特征，但由于依赖死后组织研究，其形成机制仍不清楚。同时，免疫功能障碍在 PD 发展中的作用受到关注。 研究目的：探究 PD 相关损伤（α-synuclein PFFs）和免疫挑战（如干扰素 -γ 或白细胞介素 - 1β）的双重作用对 iPSC 衍生的 DA 神经元的影响，以及是否能形成类似 LB 的包涵体。

结果

包涵体形成

DA 神经元在特定条件下形成包涵体：当 iPSC 衍生的 DA 神经元先接受 α - 突触核蛋白预形成纤维（PFFs）处理，再接受干扰素 - γ（IFN - γ）或白细胞介素 - 1β（IL - 1β）处理时，会形成包涵体。例如，在使用 0.2mg/ml IFN - γ 处理且之前有 PFF 处理的情况下，通过光学显微镜和电子显微镜观察到 PFF 阳性包涵体的形成。这些包涵体包含纳米金标记的 PFF、线粒体和丝状物质，大小约为 5 - 10μm，位于核周区域，约 15 - 20% 的神经元会形成类似路易小体（LB）的包涵体，部分神经元还会在轴突中形成包涵体。用 IL - 1β 替代 IFN - γ 进行相同处理，也能使 DA 神经元形成 PFF 阳性包涵体，这些包涵体充满异常溶酶体和功能失调的线粒体，且同样具有膜结构。

时间进程中的包涵体变化：在 14 天的处理过程中，观察到包涵体形成的时间进程。第 2 天，PFF 在溶酶体中积累；第 6 天，出现细胞应激迹象，如线粒体和内质网肿胀，溶酶体异常；第 7 天，形成含有异常溶酶体结构的微小包涵体；第 10 天，更明显的包涵体形成，包含多种结构；第 14 天，PFF + IFN - γ 处理的样本中出现大的包涵体，包含多种细胞器和结构。继续观察到 30 天，发现 PFF + IFN - γ 处理的样本中包涵体持续存在且更加紧密，充满丝状和细胞器碎片，均为膜封闭结构。而仅 PFF 处理的样本在 30 天也未形成大量包涵体。

不同细胞类型的包涵体形成差异：皮质神经元在相同的 14 天双重处理下，不形成 PFF 阳性的 LB 样包涵体，尽管也含有异常溶酶体，但无法将相关结构包装成包涵体。神经母细胞瘤（SH - SY5Y）、胶质母细胞瘤（U87）和骨肉瘤（U2OS）细胞在双重处理后也不形成包涵体，但表现出溶酶体异常，如 LAMP1 丢失和溶酶体增大。

溶酶体功能障碍

IFN - γ 对溶酶体的影响：IFN - γ 处理影响自噬并抑制溶酶体活性，导致溶酶体膜蛋白 LAMP1 和 LAMP2 下调。这使得 PFF 在神经元中的降解被破坏，PFF + IFN - γ 处理的神经元中 PFF 荧光明显高于仅 PFF 处理的神经元，且细胞数量减少。通过电子显微镜观察到，PFF + IFN - γ 处理的神经元中，含有 PFF 的溶酶体破裂，PFF 泄漏到细胞质中，同时出现大量含有细胞器碎片的自噬体 / 自溶酶体结构，表明自噬功能受损。

溶酶体膜通透性变化：在 21 天的观察中，发现 galectin - 3 被招募到 LAMP1 阳性囊泡，且在 PFF 阳性包涵体中积累。这表明溶酶体膜通透性发生变化，为 PFF 从溶酶体泄漏到细胞质提供了证据。

转录因子和蛋白质表达变化

TFEB 和 NRF2 表达下调：TFEB 和 NRF2 是调控溶酶体蛋白表达的转录因子，在 PFF 和 IFN - γ 处理的 DA 神经元中，它们的表达下调，而在皮质神经元中基本不受影响。

溶酶体相关蛋白变化：LAMP1 和 LAMP2 在皮质神经元中基线表达高于 DA 神经元，经 PFF 和 IFN - γ 处理后，DA 神经元中这两种蛋白水平大幅下降，而皮质神经元中变化不大。GBA 基因敲除（GBA - KO）的 DA 神经元在给予 PFF 时也会形成包涵体，表明 GBA 在溶酶体功能和包涵体形成中起作用。

内源性 α - 突触核蛋白的作用

磷酸化 α - 突触核蛋白与包涵体形成：经过双重处理的 DA 神经元用磷酸化 α - 突触核蛋白（pS129）抗体染色，发现形成了 pS129 阳性的聚集体，且 PFF 与磷酸化 α - 突触核蛋白共定位在包涵体中。

内源性 α - 突触核蛋白水平的影响：使用来自 SNCA 基因三倍体患者的 iPSCs 生成不同基因型的细胞并分化为 DA 神经元，发现 α - 突触核蛋白表达水平影响磷酸化 α - 突触核蛋白荧光和 PFF 阳性包涵体的形成，基因敲除细胞表现出较低的荧光和包涵体形成。内源性 α - 突触核蛋白过表达（如通过 α - 突触核蛋白 - HA 腺病毒转导）在无 PFF 时，IFN - γ 也能诱导包涵体形成。

微环境的影响

小胶质细胞的作用：将人小胶质细胞样细胞系（HMC3）用脂多糖（LPS）激活后与完全分化的 DA 神经元共培养，神经元形成 PFF 阳性包涵体。分析小胶质细胞培养基发现，LPS、PFF 和 LPS + PFF 处理的小胶质细胞分泌 IFN - γ，且 LPS + PFF 条件下 IFN - γ 信号最强，同时也分泌 α - 突触核蛋白。通过添加可溶性细胞因子受体（如 IFNGR1、IL1R1 和 TNFR2）到共培养体系中，发现可减少 PFF 荧光和包涵体形成，而添加无关受体（如 EGFR）则无此作用。

星形胶质细胞的作用：将之前接受过 IFN - γ 处理的 DA 神经元与不同数量的人星形胶质细胞共培养，发现与较多星形胶质细胞共培养的神经元 PFF 荧光明显低于与较少星形胶质细胞共培养的神经元，提示星形胶质细胞可能减轻神经炎症。

结论

包涵体形成机制：免疫触发的溶酶体功能障碍在 PD 病理发展中起重要作用，可能是包涵体形成的关键因素。

模型的意义：该研究建立的细胞模型为研究 PD 病理提供了新的工具，有助于深入了解 PD 的发病机制，并为药物研发提供了潜在的靶点。