表皮松解性掌跖角化病二家系基因突变检测

表皮松解性掌跖角化病二家系基因突变检测

郭韫懿、孙忠辉

[摘要] 目的： 研究表皮松解性掌跖角化病家系患者的临床表现及其致病原因。方法： 在二表皮松解性掌跖角化病家系家系调查的基础上，收集二家系4例患者和其家属的血样，同时采集（无亲缘关系）正常对照血样100份，采取聚合酶链反应技术对KRT1、KRT9和KRT16基因进行扩增，并对其产物进行测序。结果： 发现家系1先证者的 KRT1基因含杂合突变c.598T＞C（p.F200L）。发现家系2先证者及子女的KRT9基因含杂合突变c.488G＞A（p.R163Q）。而家系正常成员及家系外无亲缘关系的100个正常对照中均不存在此突变。结论：二个发生的突变均为已报道过的重复突变，其中KRT1基因突变p.F200L是国内首次报道。该二表皮松解性掌跖角化病家系家系发病原因是KRT1、KRT9基因发生突变所致。研究结果进一步证实：一些单基因遗传性疾病存在遗传和临床异质性。

[关键词] 表皮松解性掌跖角化症；异质性；基因突变

KRT1 and KRT9 mutations result in epidermolytic palmoplantar keratoderma : report of two Chinese families

GUO Yunyi¹ , ZHU Ying¹ , ZHANG Danlu ¹, GUO Birong², SUN Zhonghui ¹

1. Department of Dermatology, Fengxian Institute of Dermatosis Prevention and

Treatment, Shanghai 201408, China; 2. Department of Dermatology, The Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University, The First People’s Hospital of Hefei, Hefei 230022, China

Corresponding author: SUN Zhonghui ,E-mail: zhgyy3344@163.com or GUO Birong , E-mail: guobr1983@163.com

Objective: To study the clinical manifestations and causes of etiology of family epidermolytic palmoplantar keratoderma(EPPK). Methods: Based on the family survey of EPPK, we collected blood samples from probands and relatives of two EPPK families, and 100 unrelated normal control blood samples. Then, the KRT1, KRT9 and KRT16 genes were sequenced by direct sequencing. Results: It was found that the KRT1 gene in the family 1 proband 1 was heterozygous for c.598T＞C, p.F200L, and proband 2 of family 2 and his children contained mutations c.488G＞A , p.R163Q in KRT9 gene. This mutation was invisible in the normal controls of this family as well as the additional 100 unrelated normal controls. Conclusion: The two mutations have been reported as recurrent mutations, of which the KRT1 gene mutation p.F200L was first reported in China. The cause of the pedigrees of our EPPK families were the mutations of KRT1 and KRT9 genes. We should pay attention to the genetic and clinical heterogeneity in the diagnosis and treatment of EPPK in clinical practice.

[Key words] epidermolytic palmoplantar keratoderma; heterogeneity; gene mutation

基金项目：皮肤病学教育部重点实验室（安徽医科大学）开放课题基金资助项目 (AY2017-1-017) ；上海市奉贤区科委基金资助项目（20161119和20171003）

作者单位：1上海市奉贤区皮肤病防治所皮肤科，上海，201408

2 安徽医科大学第三附属医院,安徽省合肥市第一人民医院皮肤科皮肤科，合肥，230022

通信作者：孙忠辉，E-mail: szhgyy3344@163.com或 郭碧蓉，E-mail: guobr1983@163.com

表皮松解性掌跖角化病(diffuse epidermolytic PPK，EPPK)主要临床表现是手掌和足趾发生过度角化，是一种常染色体显性遗传病^[1]。目前研究显示该病是由不同致病基因引起：KRT1、KRT9和KRTl6，因此该病具有遗传异质性。

本课题组2017年诊断两个表皮松解性掌跖角化症家系，分别为KRT1、KRT9基因突变。其中KRT1基因突变p.F200L是国内首次报道。本文根据我们的基因诊断结果结合文献讨论EPPK的异质性，现报道如下。

材料和方法

1、 临床资料

1.1 先证者1，男性，58岁，工人。因双掌跖角化50余年，于2015年8月来我院就诊。先证者自4岁起无明显诱因双掌跖部出现对称性片状红斑，角化，形状不规则，受累皮肤粗糙增厚，一般无自觉症状，有时伴有瘙痒、疼痛。皮疹逐渐向周围扩展，至15岁时已累及双手整个掌侧及双足跖，部分皮疹成蜡黄色角化性斑块；指（趾）甲未见增厚、混浊。23岁后皮疹未再扩展。期间双掌、双足部皮疹反复发作，有一定季节性，冬重夏轻，伴有足部多汗（图1，a、b)。家族史：调查家族中4代人。先证者父母非近亲结婚，外祖父、母亲（均已亡）有此病史，先证者儿子正常。符合常染色体显性遗传模式（图2，a)。体格检查：一般情况良好，各系统检查未见明显异常。皮肤科检查：皮疹分布于双手掌、双足底部，主要表现为境界清楚的黄色角化斑块、丘疹，伴脱屑。

1.2 先证者2，男性，37岁，工人。因双掌跖角化30余年，于2015年6月来我院就诊。先证者自5岁起无明显诱因双掌跖部出现对称性片状红斑，角化，形状不规则，受累皮肤粗糙增厚，通常无自觉症状，有时伴有瘙痒、疼痛。皮疹逐渐向周围扩展，至20岁时已累及双手整个掌侧和双足跖，部分皮疹成坚硬蜡黄色角化斑块；指（趾）甲未见变形。20岁后皮疹未再扩展。期间双掌，双足部皮疹反复发作，呈角化过度，脱落，再角化，交替进行，有一定季节性，冬重夏轻。（图1，c、d)。家族史：调查家族中3代人。先证者父母非近亲结婚，父亲发病（已亡）；目前家族中共有患者3人，其中男性2人，女性1人。先证者儿子、女儿发病，符合常染色体显性遗传模式（图2，b)。体格检查：一般情况良好，各系统检查未见明显异常。皮肤科检查：皮疹分布于双手掌、双足底部，主要表现为境界清楚的黄色角化斑块、有皲裂。

两例先证者病理相似：角化亢进，表皮增生，粒层增厚，棘层肥厚，真皮浅层血管周围稀疏淋巴组织细胞漫润。颗粒层及棘层未见裂隙及颗粒性空泡变性，未见表皮松解(图2, e、 f)。

2、外周血DNA提取：获得知情并签署同意书后，2家系患者及亲属抽取外周血3ml。其中，家系1患者仅为先证者1；家系2患者为先证者2和一子、一女。应用QIAamp DNA blood mini kit(QIAGEN公司，德国)提取基因组DNA，标化质量浓度至10mg/µ。另外，以同样的方法提取100例无亲缘关系的健康个体基因组DNA作为对照。

3、PCR扩增及DNA测序：通过NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查取KRT1、KRT9和KRT16基因核苷酸序列,Primer3.0设计KRT1、KRT9和KRT16外显子特异性引物 (htttp://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)。PCR扩增后，所有PCR产物经纯化后直接在ABI PRISM® 3700测序仪上测序（Applied Biosystems）。测序结果与人类基因组KRT1、KRT9和KRT16基因核苷酸序列比较。使用Chromas2.2软件进行解读，并用Geneious 11.1进行比对分析。

结 果

PCR产物经测序发现：患者1家系先证者KRT1基因CDS第598处杂合T碱基成为C碱基，因此编码的苯丙氨酸变为亮氨酸。即：c.598T＞C，p.F200L。经检索HGMD（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）、LOVD（http://www.lovd.nl/3.0/home）数据库该突变是国内首先报到（图2，a)。家系2先证者及子女 KRT9基因CDS第488处杂合T碱基成为A碱基，因此编码的精氨酸变为天冬酰胺。即：c.G488＞A,p.R163Q。该突变为该病常见突变（图2，b)。而两个家系的家系内正常对照及家系外100个无亲缘关系的正常人中均不存在此突变。

2

图1 两先证者临床症状和病理。(a), (b) 先证者1；(c), (d) 先证者2。两先证者手掌和足底都有角化斑块。(e), (f)为先证者1病理, HE染色，(e) ×40，(f) ×200。

图2 家系图和测序结果。(a)家系1，参考序列(NG_008364)；（b）家系2，参考序列(NG_008300)。（标“↑”者为先证者；标“+”者为行基因突变检测）

讨 论

掌跖角化症(palmoplantar keratoderma，PPK)是一组掌跖角化疾病的统称，存在二十几种亚型。根据临床症状发生形态的不同，PPK可以分为3种类型：弥漫性（diffuse），局灶性（focal）和点状性（punctate）。由于是仅根据临床形态来分型，而每一型往往致病基因有多个，所以总的来说PPK是遗传异质性很强的一组疾病。表皮松解性掌跖角化症（EPPK）是弥漫性掌跖角化症的一个亚型，OMIM号为144200。根据国际人类中间丝数据库（Human Intermediate Filament Database，HIFD,http://www.interfil.org/）截止2014年11月22日的数据显示，目前明确的致病基因有KRT1、KRT9 和KRT16。我们在基因诊断EPPK时，虽将KRT16基因列入侯测基因，但至今未发现致病突变。既往报道过一例EPPK是KRT16突变引起，也仅是罕见的嵌合型^[2]，目前的文献表明所有KRT16基因突变基本都与先天性厚甲症^[3]有关。因此EPPK，主要致病基因是KRT1和KRT。

EPPK属于常染色体显性遗传，多为婴儿期开始发病，轻者仅有掌跖皮肤粗糙，重者掌跖处出现表皮松解性斑块状、边缘清晰的角质增厚，呈黄色胼胝体样。有时角质增厚可蔓延至掌跖皮肤侧缘或手足背，可伴有指节垫、甲板增厚浑浊、指趾屈曲畸形等。病理：表皮高度角化过度，颗粒层及棘层增厚，颗粒层及棘层；可有表皮松解，即可见裂隙及颗粒性空泡变性。EPPK与非表皮松解性掌跖角化病（NEPPK）本质是同一病，因临床改变是一样的，且都是KRT1、KRT9突变引起。NEPPK 又名“Thost” 型掌跖角化症，早在1880年由Thost 发现并命名。2002年Kuster等重新检测了Thost患者的后裔，结果组织病理还是显示有表皮松解^[4]。本研究致病突变检测上，家系1先证者的KRT1基因突变p.F200L是2016年Gagliardi^[5]已报道；而家系2的KRT9基因突变p.R163Q是目前国内外均已报道的热点突变。虽然两先证者组织病理都未见表皮松解现象，但结合临床症状和基因诊断结果，两家系患者都诊断为EPPK。

KRT9角蛋白局限性的表达于掌跖表皮中^[6]，突变引起的疾病仅是EPPK 。KRT9基因虽然异质性不强，但存在突变热点区和热点突变。数据库显示KRT9基因突变热点区位于1A区前端的157-172个氨基酸位置。在总共25个突变中位于1A区域有20个，位于2B区仅5个。基因突变频率最高的是第163氨基酸突变，Liu^[7]统计该位置约占所有报道病例的44％，而p.R163W约占29.33%,其次为p.R163Q约占10％。第163位氨基酸突变可能影响角蛋白中间丝组装，从而导致EPPK。本研究先证者2家系正是携带此突变，因而是一明确的EPPK.

相较于KRT9角蛋白，KRT1角蛋白主要表达在全身表皮的棘层和颗粒层细胞,其突变可以引起众多表型。目前显示除了EPPK，表皮松解性角化过度型鱼鳞病（EHK）、先天性大疱性鱼鳞病样红皮病（BCIE）、周期性鱼鳞病伴表皮松解性角化过度（CIEH）,豪猪状鱼鳞病（IHCM）、弥漫性非表皮松解性掌跖角化症（NEPPK）、条纹状掌跖角化症（SPPK）、常染色体显性遗传脑白质营养不良（ADLD）和 Greither综合征（GS）也与其突变有关。HIFD数据库显示KRT1突变目前有47个，大多数（32个）是引起表型相对严重的BCIE,而表型相对较轻的PPK（包括EPPK,NEPPK）仅有8个，均为错义突变。引起BCIE的突变绝大多数位于角蛋白1A和2B区域。KRT1中1A和2B是编码体内角蛋白丝装配的重要区域，该区域改变会影响角蛋白丝的形成并影响其稳定性，进而影响角蛋白网状结构形成^[8]。在8个引起PPK的突变中，影响的编码序列分别位于头（Head）、1A、1B和2B区域，未显示突变热点。PPK有遗传异质性，同样在KRT1基因也表现出了复杂的临床异质性。KRT1同一突变可在家系内引起不同表型，比如Nellen^[9] 描述一家系携带c.1016T＞A，4岁先证者是严重的表皮松解EHK。她不仅有EPPK和屈曲部位的疣状增厚，还有躯干部位过度角化伴和去除鳞屑后的糜烂。而患者家系其他患者仅有EPPK和皮肤摩擦后出现水泡。同样的，KRT1同一突变可在家系以外引起不同表型。比如国内学者报道的一例EPPK^[10]与国外报道^[11]的BCIE和CIEH的致病突变竟然都是KRT1错义突变c.1436T＞C。

然而，本研究先证者1的突变p.P200L目前文献显示仅一例为意大利报道^[5]。Gagliardi报道采用外显子测序发现一家系中既有Charcot-Marie-Tooth disease（进行性神经性肌萎缩综合征，CMT）又有PPK的患者4例，其他患者单独患有CMT或PPK各1例。作者认为这两个疾病是单独引起，致病突变分别是MPZ 基因的p.Ser44Phe 和KRTI基因p.P200L。p.P200L位于1A区域，经蛋白预测软件SIFT Pred、Polyphen2和 Mutation Taster都认为是致病突变。由于其合并其它基因突变、表型复杂，p.P200L所致EPPK的病情是否发展、有无异质性，还需随访观察。我们报道的也是同一突变PPK家系，符合文献，但无其它合并基因突变疾病。由于KRT1基因突变存在上文所述的复杂的临床异质性，所以先证者1还是需要随访、以观察其病情发展。另外，本突变在中国人群是首例报道。

综上所述，本研究的结果及文献复习提示我们在临床实践中对于诊断和治疗一些单遗传疾病要注意其遗传和临床异质性。

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