CDMP-1促进成人骨髓基质干细胞成软骨分化的研究

CDMP-1促进成人骨髓基质干细胞成软骨分化的研究D

张波* 杨述华* 张宇坤** 夏天* 孙志博*

摘要 目的 探讨软骨源性形态发生蛋白1（CDMP-1）诱导成人骨髓间充质干细胞（human bone mesenchymal stem cells，BMSCs）成软骨细胞分化可行性及最佳诱导浓度。方法 分离培养BMSCs，免疫荧光法检测BMSCs表面CD34,CD45,CD105表达。采用含0、10、50、100ng/ml CDMP-1的软骨诱导液诱导培养BMSCs 21d，倒置显微镜观察细胞形态变化； RT-PCR检测不同浓度CDMP-1组细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan表达；免疫组化检测Ⅱ型胶原表达；番红O和阿里新蓝染色检测蛋白多糖表达。结果 成人BMSCs呈梭形旋窝状生长，CD44、CD105表达阳性，CD34呈阴性表达。CDMP-1诱导7天后细胞形态逐渐由长梭形向多边形、多角形转化。不同浓度CDMP-1诱导21d，Ⅱ型胶原表达量各组间差异均具有统计学意义（P＜0.05）；Aggrecan的表达CM组和10ng组之间差异量无统计学意义（P＞0.05），其它各组间差异均具有统计学意义（P＜0.05）。免疫组化检测Ⅱ型胶原表达阳性，阿里新蓝和番红O染色均为阳性。 结论 含100ng/ml CDMP-1软骨诱导液能有效促进成人BMSCs向软骨表型分化。

【关键词】生长分化因子-5；骨髓基质干细胞；软骨细胞；分化

The experimental study of cartilage-derive morphogenetic protein 1 promotes the differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes

ZHANG Bo, YANG Shu-hua, ZHANG Yu-kun, et al. Department of Orthopedics Affiliated to Union Hospital, Tongji Medical College of Huazhong Science and Technology University, Wuhan 430022, China

Abstract Objective To explore the effects and the best-induced concentration of cartilage-derive morphogenetic protein 1 promotes the differentiation of human bone mesenchymal stem cells(BMSCs) into chondrocytes. Methods BMSCs were isolated from ilium and purified. Immumofluorescence method were performed to detect he cell surface marker of CD34、CD45、CD105. BMSCs were induced with different CDMP-1 concentrations (0, 50, and 100 ng/ml) for three weeks. Morphological changes of cells was observed, The mRNA quantities of Col Ⅱ and Aggrecan expressed by the induced MSCs of each groups were detected with RT-PCR. Immunohistochemistry method were performed to detect the expressrion of Col Ⅱ, and the proteoglycan synthesized were detected with alcian blue staining and Safranin O staining. Rusult Primary BMSCs proliferated in visible colonies with spindle-shaped whirl pool. BMSCs expressed CD44 and CD105 strongly, but CD34 were expressed negatively. After 7 days of induction with 100ng/ml CDMP-1, the BMSCs developed from spindle-shaped to polygon or elliptic shape. The expression of collagen II has a statistically significant difference between the all groups（P＜0.05）.The expression of Aggrecan were significant differences among all the groups(P<0.05)，except that no significant difference was evident between the CM group and the 10 ng/mL group(P>0.05). After 21 days of induction with 100ng/ml CDMP-1, the results of Col II Immunohistochemistry staining, alcian blue staining and Safranin staining were positive. Conclusion 100ng/ml CDMP-1 can effectively promote the differentiation of adult BMSCs to chondrocytes.

【Key word】 Cartilage-derive morphogenetic protein 1；Bone mesenchymal stem cells；Chondrocytes；Differentiation

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)是一类具有自我更新与多分化潜能的细胞，在特定生长因子作用下可向软骨细胞分化，因而成为软骨组织工程的理想种子细胞。软骨源性形态发生蛋白1（cartilage-derive morphogenetic protein 1，CDMP-1），属骨形态发生蛋白家族成员,具有特异的软骨诱导能力,可在异位诱导软骨形成^[1]。目前国内外学者主要采用转化生长因子-β1（TGF-β1）单独或联合胰岛素样生长因子（IGF）作为软骨细胞诱导因子^{[2, 3,4]}，而CDMP-1诱导BMSCs向软骨细胞方向分化的研究报道较少。本研究探讨含不同浓度CDMP-1的软骨诱导液诱导成人BMSCs向软骨细胞分化的可能性及最佳诱导浓度,从而为软骨组织工程的种子细胞来源提供一种新的思路。

1.材料与方法

1.1试剂 DMEM-L培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶购置于Gibco公司； CDMP-1购置于peprotech公司； ITS+、L-脯氨酸、丙酮酸钠、阿利辛蓝等购置于Sigma公司；anti-human CD34、CD44、CD105购置于Biolegend公司，兔抗人Ⅱ型胶原抗体（Santa Cruz），FITC标记或Cy3标记的羊抗兔二抗（sigma）；TRIzol Reagent（Invitrogen）、ReverTra Dash（TOYOBO）、2×Taq PCR MasterMix（TIANGEN），GoldView；SABC，DAB显色试剂盒；PCR仪（Biometra,T3型），荧光倒置显微镜（OLYMPUS CX21FS1）

1.2 实验方法

1.2.1 BMSCs的分离、扩增及鉴定 骨髓取自本科室因颈椎骨折需行髂骨移植的成人患者,共5例，平均年龄42岁，经检查无重大疾病。经过患者同意后，在手术过程中，采用肝素处理注射器无菌条件下抽取骨髓2ml～3 mL，立即加入含5ml 15%FBS的DMEM-L培养基的透气孔培养瓶中,轻轻吹打悬液细胞,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中，3天后更换为含10%FBS的DMEM-L培养基培养，以后每隔3d换液，倒置显微镜下观察细胞生长情况和形态特征，待细胞接近融合时用0.25%胰蛋白酶消化，以1∶2比例传代。

将多聚赖氨酸包被的无菌清洁盖玻片置于无菌六孔板中，取P4 BMSCs进行细胞爬片，用常规免疫荧光法鉴定。步骤如下: 爬片经固定、漂洗、破膜、山羊血清封闭处理后，分别滴加1：100稀释的抗CD34、CD44、CD105抗体置于4℃过夜，PBS漂洗。CD34、CD105鉴定加入1：100稀释FITC标记的羊抗兔二抗，CD44鉴定加入1：200稀释Cy3标记的羊抗兔二抗，37℃避光孵育1h，PBS漂洗后，采用抗荧光粹灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察。

1.2.2 BMSCs成软骨细胞诱导培养 取生长良好的P4代细胞，以1×10⁵cells/ml接种于6孔板内，加入含10%FBS的DMEM-L完全培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养12h。然后分别更换为含0、10、50、100ng/ml CDMP-1的软骨诱导液（conditioned medium ，CM）连续诱导3周，每隔3天更换CM并加入相应浓度的CDMP-1。CM成分为含10^-7M地塞米松、50μg /ml 维生素C、1％FBS、1%ITS+、40μg /ml L-脯氨酸和100μg /ml丙酮酸钠的DMEM高糖溶液。

1.2.3 RT-PCR检测诱导细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan表达 不同浓度CDMP-1诱导BMSCs 3周后，按Trizol说明书提取总RNA，进行RT-PCR。Collagen Ⅱ引物序列：上游TTCAGCTATGGAGATGACAATC，下游AGAGTCCTAGAGTGACTGAG，扩增片段长度为472 bp；Aggrecan引物序列：上游TGACCACTTTACTCTGGGTTTTCG，下游ACACGATGCCTTTCACCACG，扩增片段长度为462 bp；GAPDH引物序列：上游引物ACCACAGTCCATGCCATCAC，下游：TCCACCACCCTGTTGCTGTA，扩增片段长度为450 bp。

RT和PCR步骤按常规进行。反应条件为：94℃预变性3min；然后执行40个循环：94℃变性30 s，退火30 s，退火温度CollagenⅡ为56℃，Aggrecan为52℃；72℃延伸1min；最后总延伸72℃ 5 min。反应结束后取PCR扩增产物5μl，在含有Goldview的2%琼脂糖凝胶中电泳，将电泳凝胶置于BioSpectrum®AC凝胶成像系统照相。

1.2.4 Ⅱ型胶原组化检测 将100ng/ml CDMP-1诱导21d的BMSCs消化制作细胞爬片。4%多聚甲醛4℃固定30min,用含0.1%Triton溶液破膜30min，用含3% H₂O₂ 的PBS溶液室温灭活15min,山羊血清室温封闭30min，小心甩干封闭液，PBS冲洗3次，每次3min。按1：100稀释兔抗人Ⅱ型胶原多克隆抗体，4℃孵育过夜。应用SABC免疫组织化学染色试剂盒，按照试剂盒说明操作，最后用 DAB试剂盒显色，检测组织中Ⅱ型胶原的表达,阳性反应呈棕黄色。以PBS代替一抗作阴性对照染色。

1.2.5 番红O染色 将BMSCs按照1×10⁵cells/ml接种于6孔板内，采用含100ng/ml CDMP-1的诱导液培养21d，PBS漂洗3min。 4%多聚甲醛4℃固定30min。采用1% 苏木精染色液染色10min，PBS漂洗10min，用0.001%FCF溶液染色5min，1%冰醋酸迅速分化10-15秒。然后用0.1%番红O染色5min，PBS漂洗后置于倒置显微镜系统成像。

1.2.6 阿利新蓝染色 将BMSCs按照1×10⁵cells/ml接种于12孔板内，采用含100ng/ml CDMP-1的诱导液培养21d，PBS漂洗3min。 4%多聚甲醛4℃固定30min。漂洗后用1%阿利新蓝冰醋酸溶液（PH2.5）室温染色30min，蒸馏水漂洗2min，用0.1%中性核固红溶液染色5min。蒸馏水冲洗后置于倒置显微镜系统成像。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件包分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P值<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs的形态学观察及鉴定

全骨髓培养第3d，换液后可见瓶底有少数细胞集落形成，细胞呈梭形或多角突起状。随着培养时间延长,，贴壁细胞开始分裂增生,呈旋涡状向四周扩增生长(图1b)。约14d～20d 可达90%融合，并出现明显漩涡状排列。采用免疫荧光法对BMSCs表面分子进行鉴定，结果显示： CD44、CD105为阳性，CD34为阴性。连续传代后BMSCs表面分子表达无明显改变。

2.2 BMSCs向软骨细胞诱导形态变化

不同浓度CDMP-1诱导4d，细胞形态变化不大,仍保留BMSCs典型的梭形，随着CDMP-1浓度增加，细胞增殖能力增强。 诱导7d后，50ng/ml和100ng/ml组细胞增殖明显，体积变大，细胞形态逐渐由长梭形向多边形、类圆形转化，CM组和10ng/ml组细胞仅表现出一定程度细胞数量增加，细胞仍为长梭形。继续诱导至21d，各组细胞体积均不同程度增大，数量增多，细胞由单层变成多层生长。50ng和100ng组细胞得宽大扁平，细胞胞浆丰富,并分泌大量基质。100ng组可见局部细胞集聚形成团块状结晶。

2.3 BMSCs向软骨细胞诱导分子学变化

BMSCs用含不同浓度CDMP-1的CM导3周后，结果显示随着CDMP-1浓度的增加， Ⅱ型胶原和Aggrecan在mRNA水平的表达增加。Ⅱ型胶原表达量各组间差异均具有统计学意义（P＜0.05）(图1a)。 Aggrecan的表达CM组和10ng组之间差异量无统计学意义，其它各组其差异均具有统计学意义（P＜0.05）(图1b)。

2.4 BMSCs向软骨细胞诱导组织学变化

根据以上RT-PCR结果并查阅文献，实验选取100ng/ml CDMP-1诱导BMSCs，检测BMSCs向软骨细胞诱导组织学变化。结果显示Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性表达（图1a），阿利新蓝染色处于密集处的细胞间隙，尤其是细胞团块状聚集结节处无定形物质染色呈强阳性（图2b），番红O染色可见胞浆呈红色，细胞密集处可见无定型物质呈现强阳性（图2c）。

3 讨论

机械损伤和关节退行性改变常导致关节软骨损伤发生，关节软骨内无血管神经分布，软骨细胞细胞密度低且缺乏正常组织修复的生长因子，因而缺乏自我修复能力。自体软骨移植虽能有效改善软骨缺损，但是自体软骨细胞来源困难以及供体部位二次损伤束缚软骨细胞移植和软骨工程学发展^[5,6]。因此寻找一种细胞来源丰富且能够产生足够的软骨细胞外基质的细胞作为种子细胞治疗关节软骨损伤具有重要临床意义。BMSCs是一类具有自我更新与多向分化潜能的细胞, 它能够分化为骨，软骨，脂肪，肌腱及肌肉等组织，而且自体BMSCs存在于自身的骨髓组织中,采集方便,对机体损伤小,不存在免疫排斥、疾病传播等问题,因此 MSC是软骨组织工程中理想的种子细胞来源^[7]。

BMSCs分离培养是实验的关键。目前常用的分离BMSCs的方法主要有3种，即密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和全骨髓培养法。密度梯度离心法优点是分离细胞纯度较高，但是该方法需要标本量大，而且经过多次离心对细胞损伤较大，细胞容易老化，增殖能力下降^[8]。流式细胞仪分选获得细胞纯度最高，但是操作过程繁琐，且价格较为昂贵。本实验采用全骨髓培养法培养与贴壁筛选法相结合，经过3-4代贴壁筛选，能够有效的除去分离培养中出现的杂质血细胞，传代后所获得的BMSCs细胞形态均一，细胞纯度高，增殖速度快，生长性状稳定，细胞为均一的成纤维样，具有BMSCs一般的特性。本实验采用免疫荧光法对BMSCs细胞表面分子进行鉴定，结果获取的BMSCs表面CD44,CD105分子阳性表达， CD34分子阴性表达，符合MSC表型。

CDMP-1，也称生长分化因子-5（Growth differentiation factor5，GDF-5），是近年发现的一种生长因子，属骨形态发生蛋白家族成员，也是转化生长因子β超家族一员，其编码基因是Hotten等^[9]从人胎儿胚胎cDNA库中克隆获得，基因全长488 kb，其编码多肽共含有501个氨基酸，由位于N端的信号肽、中间的前体肽以及C端的成熟肽构成，翻译后的前体蛋白裂解得到成熟肽，由其发挥生物活性作用。CDMP-1 优势表达于软骨，如胚胎发育时长骨的软骨中轴、胎儿的关节软骨以及成年人的关节软骨，而通常 BMP 成员在这些区域没有或仅微弱表达。CDMP-1主要通过影响生长板软骨细胞肥大时期的持续时间来调节内生软骨的骨生长速度^[10]。CDMP-1突变在小鼠和人类中表现为严重的软骨发育不良畸形,骨骼和四肢短小畸形且先天性软骨发育不良；过表达CDMP-1可增加骨骼长度，增加软骨合成，产生关节融合，表明CDMP-1在肢体骨骼发育和关节形成中有着很重要的作用^[11]。有关CDMP-1与胚胎发育学研究较多，但CDMP-1诱导干细胞体外软骨分化研究和作用机制尚不清楚。Feng^[12]等证明腺病毒载体介导的CDMP-1基因转染脂肪基质干细胞，可促进其向软骨分化，但其诱导效应小于外源性补充CDMP-1。然而Yoshimoto^[12]等研究证明重组CDMP-1活体小鼠颅顶注射可导致异位骨形成。CDMP-1通过与TGF-β家族的BMPR-Ⅱ受体结合，从而募集BMPR-IB受体和激活素受体Ⅱ并以之形成复合物，再通过Smads或P38MAPK途径化激活下游信号调节通路；同时CDMP-1可以通过Cx43介导的缝隙连接细胞间通讯来增强细胞间信号的传导和协调^[14]，从而促进间充质细胞聚集同时向软骨方向分化，促进软骨细胞合成代谢，增加软骨细胞合成特异性ECM氨基葡聚糖，维持软骨表型。

本研究采用单层培养方法探讨不同浓度CDMP-1对成人BMSCs细胞诱导软骨分化的作用。结果表明在含CDMP-1的CM诱导下，成人BMSCs逐渐向软骨样细胞分化, 单纯CM组和10ng/ml组也能诱导BMSCs增殖，但细胞增殖速度较慢，细胞形态改变较小；50ng/ml组和100ng/ml组细胞形态逐渐由长梭形向多边形、类圆形转化，细胞增殖显著，增殖的细胞由单层向复层生长,进而发生聚集, 100ng/ml组可形成多个细胞小结；PT-PCR显示随着CDMP-1浓度的增加，Ⅱ型胶原和Aggrecan在mRNA水平的表达增加，单纯CM本身具有一定的软骨诱导作用， 因而本实验单纯CM组也有微弱Ⅱ型胶原表达，但是随着CDMP-1浓度增加，Ⅱ型胶原表达明显增加，且各组间差异具有显著性。CM组和10ng/ml组未检测到Aggrecan表达，而50ng/ml组和100ng/ml组均可检测到Aggrecan高表达，也呈剂量依赖变化。采用免疫组化染色法检测诱导21天后Ⅱ型胶原表达为阳性，表明BMSCs已向软骨细胞表型分化并具有分泌软骨细胞特异性Ⅱ型胶原的功能。阿利新蓝能与酸性糖蛋白形成复合物，使得细胞基质呈蓝色异染；番红O用于检测细胞硫酸化葡萄糖胺聚糖分布，与GAG反应后呈现红色异染。在细胞小结区域内, 阿利新蓝染色和番红O染色均呈现明显的阳性异染反应，表明BMSCs已向软骨细胞表型分化并能够分泌软骨细胞特异性酸性糖蛋白。

综上所述，本研究从形态学，分子生物学，组织学水平分别证实了一定浓度 CDMP-1能有效的诱导BMSCs向软骨细胞分化，为软骨组织工程种子细胞获取提供了新的思路，并为进一步的临床软骨损伤修复研究提供理论和实验依据。

参考文献

[1] Erlacher L, Ng CK, Ullrich R,et al. Presence of cartilage-derived morphogenetic proteins in articular cartilage and enhancement of matrix replacement in vitro. Arthritis Rheum. 1998. 41(2): 263-73.

[2] Vinardell T, Thorpe SD, Buckley CT, et al. Chondrogenesis and Integration of Mesenchymal Stem Cells Within an In Vitro Cartilage Defect Repair Model. Ann Biomed Eng. 2009.37(12): 2556-2565..

[3] Guo CA, Liu XG, Huo JZ, et al. Novel gene-modified-tissue engineering of cartilage using stable transforming growth factor-beta1-transfected mesenchymal stem cells grown on chitosan scaffolds. J Biosci Bioeng. 2007. 103(6): 547-56.

[4] 韩建伟, 杨彤涛, 孙宏慧 等. 成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为软骨细胞的实验研究. 中国骨与关节损伤杂志. 2008. (11): 912-914.

[5] Mainil-Varlet P, Rieser F, Grogan S, et al. Articular cartilage repair using a tissue-engineered cartilage-like implant: an animal study. Osteoarthritis Cartilage. 2001. 9 Suppl A: S6-15.

[6] 孙涛, 王英振. 同种异体软骨细胞移植术后关节软骨蛋白多糖的测定. 中国骨与关节损伤杂志. 2008. (03): 214-217.

[7] Tocci A, Forte L. Mesenchymal stem cell: use and perspectives. Hematol J. 2003. 4(2): 92-6.

[8] 吕昌伟, 胡蕴玉, 白建萍 等. 转壁反应器三维立体培养多样本骨髓间充质干细胞实验研究. 中国骨与关节损伤杂志. 2008. (07): 561-563.

[9] Hotten G, Neidhardt H, Jacobowsky B, et al. Cloning and expression of recombinant human growth/differentiation factor 5. Biochem Biophys Res Commun. 1994. 204(2): 646-52.

[10] Francis-West PH, Abdelfattah A, Chen P, et al. Mechanisms of GDF-5 action during skeletal development. Development. 1999. 126(6): 1305-15.

[11] Coleman CM, Tuan RS. Growth/differentiation factor 5 enhances chondrocyte maturation. Dev Dyn. 2003. 228(2): 208-16.

[12] Feng G, Wan Y, Balian G, et al. Adenovirus-mediated expression of growth and differentiation factor-5 promotes chondrogenesis of adipose stem cells. Growth Factors. 2008. 26(3): 132-42.

[13] Yoshimoto T, Yamamoto M, Kadomatsu H, et al. Recombinant human growth/differentiation factor-5 (rhGDF-5) induced bone formation in murine calvariae. J Periodontal Res. 2006. 41(2): 140-7.

[14] Coleman CM, Tuan RS. Functional role of growth/differentiation factor 5 in chondrogenesis of limb mesenchymal cells. Mech Dev. 2003. 120(7): 823-36.