HPV致癌蛋白E6/E7诱导细胞恶变的分子机制

在所有人类癌症中，5%的恶性肿瘤发病都与人乳头瘤病毒(HPVs)有关，而宫颈癌和HPV是关系最密切的。E6/E7两种病毒蛋白对于恶性肿瘤的发展和维持是至关重要的。维持细胞稳态的关键通路是这两种蛋白主要的作用位点。它们对细胞作用的结果是营造一个有利于病毒存活的环境；但是当受到干扰时就会导致对宿主细胞的改变，最终导致恶性肿瘤的发生发展。

HPVs是一种小型的双链DNA病毒，特异性感染上皮细胞。HPV家族包含约200种病毒亚型。每种病毒亚型的组织特异性是不同的。大多数的HPV亚型引起的病变均为良性的，具有自限性；只有少部分病毒为高危亚型，可以引起人类的恶性肿瘤。这些肿瘤包括宫颈癌，肛门生殖器以及头颈部肿瘤。HPV高危亚型有其独特的生物学特性，他们能够干扰宿主对细胞增殖和基因组稳定的调控能力。几乎所有的宫颈癌（>99%）都与高危HPV感染有关。HPV感染的最初几个月，患者是没有任何症状的，并且大约90%的感染会在2年内通过宿主的免疫系统清除。只有那些不能通过免疫系统清除的高危HPV持续性感染，才会导致宫颈癌的发生。HPV16，18是导致宫颈癌的最常见亚型，全球80%宫颈癌发病都与他们有关。其他高危亚型包括31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58和59。

HPV诱导癌变的特征之一，即表现为E6/E7两种病毒蛋白的持续表达，贯穿于肿瘤发生的全程，并维持癌症表型。如果抑制E6和或E7的表达和功能，肿瘤细胞的增殖停滞并发生凋亡。因此，他们是治疗HPV诱导的恶变的理想靶点。

HPV生命周期：从感染到恶变的演进

HPV生命周期与宿主上皮细胞的分化密切相关。复层鳞状上皮因为微小损伤导致基底层暴漏，HPV感染基底层细胞。HPV生命周期由此开始，因为只有基底层细胞是具有增殖能力的。HPV感染宿主细胞后，以染色体外元件或附加体的形式构建基因组，依靠细胞复制蛋白调节病毒DNA合成。HPV感染过程中，非基底层细胞大部分处于正常的细胞周期，而一小部分细胞重新进入S期完成HPV病毒基因组的扩增。与此同时，病毒衣壳蛋白及病毒体组装随之完成，最终具有感染性的病毒颗粒被释放出来。E6/E7蛋白与细胞周期调控因子（pRb蛋白，E2F转录因子，P53等）相互作用，细胞周期节点（chekpoints）被废除,最终导致感染细胞的“永生”。由于E6/E7蛋白干扰细胞正常周期，导致细胞不断合成DNA，DNA损伤监控失控，很容易引起突变的发生。突变可以是点突变，也可以是大段染色体突变。HPV感染宫颈细胞，一般情况下出现程度较轻的细胞异常，组织学上表现为宫颈上皮内瘤变（CIN1-2）。这种程度的病变伴随着免疫系统对病毒的清除可以在1-2年内消退。然而HPV有多种机制可以抵抗免疫系统，即免疫逃避，从而导致宿主细胞的持续性感染，最终形成宫颈癌。

在低级别病变中，HPV以游离体的状态存在于宿主细胞中；而在高级别病变中，其基因组是整合到宿主细胞染色体内的。目前这些整合位点还没有被识别，但引起基因组不稳定的脆弱位点已经被发现。近年研究发现，在宿主细胞染色体的脆弱位点有HPV基因组的复制，并“劫持”宿主的DNA损伤应答，病毒整合到这些位点的几率增加，反过来进一步促进这些区域的DNA重组。HPV诱导细胞恶变过程中病毒基因组整合的精确作用存在争论，似乎与E6/E7的表达失控有关。维持宫颈癌细胞株持续增殖的必要条件是E6/E7蛋白的持续表达。众多实验通过抑制E6/E7的表达，获得了这方面的证据。

E6蛋白有众多的与其相互作用的伴侣蛋白；这些蛋白有不同的生物学功能。其中P53肿瘤抑制因子是最重要的一个。E6蛋白与泛素连接酶结合使其维持稳定状态，再与P53蛋白结合形成三聚体，使P53蛋白发生多聚泛素化，失去了对细胞生长、凋亡和DNA 修复的调控作用。E6蛋白的这种作用一般只见于高危HPV。E6的靶蛋白均具有一个共同的α螺旋结构，调节E6与泛素连接酶的结合。因此，如果对α螺旋结构进行干预，势必会影响E6蛋白的多种生物学功能。目前还无法明确每个伴侣蛋白与 E6结合后发挥的具体生物学作用。低危HPV的E6蛋白虽然也与P53相互作用，但主要对病毒生命周期发挥作用，而不会诱导癌变。高危HPV亚型E6蛋白的羧基端有一段特殊的氨基酸，可以与细胞内的一组特异蛋白结合，这被认为是其致癌潜能的标志。而这种结构在低危HPV亚型的E6蛋白中是缺失的。与E6蛋白特殊结构域结合的细胞蛋白均具有重要的生物学功能，例如细胞粘附、细胞链接以及细胞极化等。E6蛋白与这些细胞蛋白结合，使细胞更具有侵袭性，或者可以使E6维持高表达。

和E6蛋白类似，E7蛋白可以和伴侣蛋白结合发挥多种生物学功能和活性。高危HPV亚型的E7蛋白最重要的结合靶点是肿瘤抑制因子pRB蛋白，在cullin 2泛素化连接酶介导下，使pRB蛋白功能失控。E7蛋白还可以通过调节细胞周期蛋白激酶从而使细胞周期失调控。

HPV表达的E6/E7蛋白不能直接将正常细胞转化为癌细胞。他们可以使宿主细胞发生基因组不稳定性，而后者正是细胞恶变的必要条件。宿主细胞染色体出现单倍体、三倍体、双微小体等异常均与E6/E7蛋白的表达有关。使细胞发生基因组不稳定是E6/E7蛋白诱发癌变的早期事件，早于其基因组整合入宿主细胞染色体。有研究发现宫颈癌的癌前病变中存在染色体非整倍体现象，这与前面的理论不谋而合。而在低危HPV感染的细胞中却没有这种现象。另外，高危E6/E7蛋白的表达使有丝分裂缺陷出现，包括多极有丝分裂、后期桥体、非整倍体等。多极有丝分裂常与异常中心体数目、核异型共同存在。研究表明，异常的中心体扩增是基因组不稳定的早期变化。E7蛋白使细胞在单一的S期内发生多次中心体合成，而这些中心体是由一个母系中心粒转变而来，具有不成熟性。正常情况下，出现异常有丝分裂会导致细胞死亡；而E6/E7的协同作用让细胞携带这些异常有丝分裂而继续存活，最终结果是多倍体细胞的不断积累增多。过度生长的异常细胞最终导致癌变的发生。

E6/E7蛋白的表达，通过抑制P53功能使细胞正常的DNA损伤应答失活；它们都可以独立的诱导细胞DNA损伤，增加了HPV基因组整合入宿主细胞基因组的几率。宿主细胞DNA损伤修复功能也出现异常，是有缺陷的损伤修复。DNA损伤应答的异常导致细胞基因组不稳定性的出现，最终导致癌变的发生。

高危E6/E7蛋白可以影响细胞多个调节通路，并通过多种方式打乱细胞内稳态的环境。使宿主细胞发生癌变的另一个重要因素就是感染时间长短。一个完整的病毒生命周期需要2-3周，只有在足够长的感染时间内宿主细胞的基因发生改变，进而才会促使细胞恶变。目前研究的一个热点问题是HPV感染的宿主细胞是否具有干细胞的特点。宫颈转化区的干细胞或储备细胞是HPV感染的主要宿主细胞。HPV感染使宫颈转化区细胞形成不典型增生是HPV感染长期潜伏的基础，尤其是宫颈鳞-柱交接部的细胞，与HPV相关的宫颈癌发生有主要关系。鳞-柱交接部的细胞为胚胎起源，是一种单层的立方上皮，其基因表达系统不同于转化区其他位置的宫颈细胞。在宫颈CIN病变和宫颈癌中发现一些特殊蛋白，体外的鳞状上皮细胞E6/E7不能诱导这些蛋白表达，尤其当宫颈鳞-柱交接部的组织通过锥切或leep手术切除后，这些蛋白的表达缺失。

有学者正在寻找鉴别宫颈干细胞的方法，有研究发现CD66+的细胞具有恶变潜能。虽然宫颈干细胞的假说证据有限，但还是比较令人信服的。“宫颈干细胞”、“储备细胞”以及鳞柱交接部细胞和宫颈癌发生的关系，是当前宫颈癌研究的热点。肿瘤细胞的异质性是临床治疗的巨大挑战，继续寻找这些细胞的标志性特点成为治疗的新靶点是未来研究的方向。

综上，E6/E7蛋白在HPV相关恶性肿瘤中具有重要作用。方兴未艾的“组学”技术以及个体化医疗，给我们临床治疗恶性肿瘤提供了新的方向。随着对E6/E7蛋白诱导HPV相关癌症的分子机制研究的不断深入，其可能会成为临床宫颈癌治疗的新靶点。

文献来源：

1.Suruchi Mittal, Lawrence Banks, Molecular mechanisms underlying human papillomavirus E6 and E7 oncoproteininduced cell transformation, Mutation Research-Reviews in Mutation Research. http://dx.doi.org/10.1016/j.mrrev. 2016.08.001

2.Julia Durzynska, Krzysztof Lesniewicz, Elzbieta Poreb, Human papillomaviruses in epigenetic regulations, Mutation Research 772 (2017) 36–50. http://dx.doi.org/10.1016/j.mrrev.2016.09.006