CPG ODN对人胰腺癌细胞株Panc-1生物学行为的影响及TLR9蛋白在胰腺癌中的表达

吴汉青 王博 朱世凯 张建军 王春友 吴河水^*

【摘要】目的 检测TLR9在人胰腺癌及胰腺癌细胞中的表达，研究CPG ODN2216对Panc-1细胞生物学行为的影响，并探讨其临床意义。方法 通过免疫组织化学方法确认TLR9蛋白在胰腺癌组织中的高表达，免疫荧光确认其在胰腺癌细胞株Panc-1中的高表达。通过细胞粘附、划痕实验、侵袭实验、细胞克隆及MTT增值实验，研究CPG ODN2216对细胞粘附力、活动力及增殖力的影响。结果 人胰腺癌标本及人胰腺癌细胞株Panc-1均高表达TLR9。划痕实验、体外粘附实验、基质胶侵袭实验、细胞克隆实验证明CPG ODN2216实验组细胞粘附力及活动力明显低于未加序列对照组。MTT法检测序列组增殖力明显低于未加序列对照组，且增值活性具有时间剂量依赖性。结论TLR9基因与人类胰腺癌的侵袭转移潜能相关，外源配体CPG ODN2216的使用可明显抑制人类胰腺癌细胞Panc-1的侵袭、迁移能力。

【关键词】CPG ODN2216, 胰腺肿瘤, Toll样受体9,细胞生物学

Influence of CPG ODN down-regulation on biology of pancreas cell line PANC-1 and the expression of TLR9 in human pancreatic cancer

Han-Qing Wu, Bo Wang, Shi-Kai Zhu, Jian-Jun Zhang, Chun-You Wang, He-Shui Wu

Department of Pancreatic Surgery Center ,Union Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology ,Wuhan Hubei 430022,China

Correspondence to: Professor He-Shui Wu, Email:heshuiwu@163.com.

[Abstract] Objective: To detect the expression of Toll-like receptor 9 (TLR9) in pancreatic cancer and investigate the effect of CPG ODN2216 on biological behavior of the pancreatic cell carcinoma, and to explore their clinical significance. Methods: The immunohistochemical method were used to examine the expression of TLR9 protein in the pancreatic cancer tissue and immunofluorescence staining was also performed to detect the TLR9 protein expression in pancreatic carcinoma cells．In vitro cell adhesion, Wound-healing scrape assay, transwell invasion assay and cell colony formation assay were performed to assess the effect of CPG ODN2216 on the invasive properties of Panc-1 cells. Results: The TLR9 were high expressed in the pancreatic cancer tissue and pancreatic carcinoma cells. In vitro experiments as cell spreading assays、cell adhesion、colony formation assay and invasion assays showed the cell adhesion and cell motility properties of CPG ODN 2216 group were apparently weakened compared with the

Control group. The MTT assay showed cell proliferation ability in the CPG ODN group was notably decrease, and CPG ODN2216 had inhibitive effects on growth of panc-1 cells in a dose and time-dependent manner.Conclusions:TLR9 gene is correlated with the invasive and metastatic potential of pancreatic carcinoma, and used of CPG ODN2216 induces the inhibition of migration and invasion of Panc-1 cell line.

[Key Words] CPG ODN2216; Pancreatic neoplasms; Toll-like receptor 9;Oncogenesis

近来发现toll样受体可能参与多种恶性肿瘤的发生、发展过程^[1]。而TLR9为该家族重要成员，能够刺激B细胞和树突状细胞分泌大量的细胞因子和趋化因子，如白介素(IL)-12、IL-6、干扰素-γ、单核细胞抑制蛋白和金属基质蛋白酶的表达^[2]。很多肿瘤都出现TLR9高表达现象，为了研究TLR9基因在胰腺癌发生过程中所起的作用，在证实其在胰腺癌中高表达后，我们采用TLR9的特异性配体人工合成的寡脱氧核甘酸2216（CPG ODN2216）刺激胰腺癌细胞Panc-1,观察胰腺癌细胞的生长增殖、成瘤能力和侵袭能力等恶性表性方面的变化，验证TLR9基因在胰腺癌细胞发生和生长中所起的作用，为进一步研究TLR9基因的具体作用机制提供信息。

1. 材料与方法

一、 实验材料

1.       细胞：人胰腺癌细胞Panc-1由华中科技大学同济医学院附属协和医院普外实验室提供，Panc-1用含10％胎牛血清、100μmoL/ml青链霉素的DMEM高糖培养液在5％CO2、37℃条件下培养。

2.       组织切片：30例人新鲜胰腺癌组织及相应的癌旁组织（据肿瘤边缘1-2cm）取自胰腺癌患者，10例正常胰腺组织标本取自其他原因需行胰腺部分切除的非肿瘤患者，所有标本均为华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科中心接受手术治疗的胰腺癌患者且经术后病理证实。

3.       主要试剂: CpG-ODN2216（序列GGGGGACGATCGTCGGGGGG），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，全硫代磷酸化修饰，PAGE纯化；TLR9单克隆抗体(cell signaling公司)。免疫组化及荧光试剂盒（武汉博士德公司）。Transwell小室（Coring公司）。Matrigel胶（Sigma公司）； MTT与DMSO（sigma公司）。

二、 实验方法

1. 免疫细胞荧光化学：用胰酶消化胰腺癌Panc-1细胞制成单细胞悬液，将单细胞悬液滴到玻片上。根据细胞生长状态，24小时或更长时间适时取出爬片。PBS漂洗三次，每次5min，用4%的多聚甲醛固定15min；PBS漂洗三次，用0.5%Triton穿孔20min；PBS漂洗三次，用5%BSA封闭30min；甩干液体后，直接加入稀释的一抗，对照组用PBS代替一抗。于4℃孵育过夜；PBS漂洗三次，加入稀释的二抗，于37℃孵育1h；PBS漂洗三次，加入稀释的SABC-FITC，于37℃孵育30min；PBS漂洗三次，水溶性封片剂封片，荧光显微镜观察。

2. 免疫组织化学：石蜡切片脱蜡后，酒精水化。3％过氧化氢室温下浸泡10 min。切片在0.01moL枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)中抗原修复。用5％山羊血清BSA室温封闭30 min，弃封闭液。加入适当稀释的一抗，对照组用PBS代替一抗，4℃过夜。PBS漂洗3遍，每遍5min；加生物素标记的二抗室温孵育30 min，PBS洗3遍；加入SABC，室温孵育30min。PBS清洗后DAB染色，苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜观察结果。

3. 二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测胰腺癌细胞的增殖：将消化的胰腺癌细胞悬液按1×10³/孔接种于96孔培养板中，每孔100μl。37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养，24h细胞贴壁后，用不同浓度(0.1μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml)的CPG ODN2216作用细胞Panc-1,分别于培养后24h、48h、72h，加入浓度为5mg/ml的MTT20μl；培养4 h，弃上清，加入二甲基亚砜，150μl/孔，震动混匀，用酶标仪，在波长490nm处测定A值。抑制率=(A_对照组-A_药物组)/A_对照组×100％^[3]。绘增殖抑制曲线，测半数抑制浓度(IC50)。

4. 划痕实验：将细胞浓度2×10⁵/ml的Panc-1细胞悬液按每孔3ml加入6孔板，培养24h或更长时间，细胞生长达80％满后，弃培养液，加入浓度分别为1μg/ml、10μg/ml的CPG ODN2216的培养液，继续培养24h。弃上清，采用细胞刮刀在孔中央对细胞作一划痕，沿划痕边缘等距离间隔作4个标记作为数据测定点，测量时取平均值。PBS轻洗；加浓度分别为1μg/ml、10μg/ml的CPG ODN2216培养液继续培养，每6小时观察1次，测量各个时间点的划痕两侧细胞间的距离。

5. 细胞黏附实验：96孔板铺胶，风干，BSA封阻，孵育60 min；将对照组及实验组(CPG ODN 1μg/ml、10μg/ml两种浓度干扰24 h)细胞浓度调整为(5×10⁵)/ml，接种200μL/孔，孵育1h，PBS洗涤，加入浓度为5mg/ml MTT，培养4h；弃培养液，DMSO溶解20min；在波长490nm处测定A值；细胞黏附抑制率(％)=(A_对照组-A_药物组)/A_对照组×100％。每组细胞设三个副孔，取平均值。

6. 细胞侵袭实验：在Transwell上室膜上室侧加入30μL人工基底膜胶并风干，分别加入200μL（含1×10⁵个细胞）饥饿培养24h的细胞，调整CPG ODN的浓度为1μg/ml、10μg/ml。在侵袭小室下室加500μL含10%FBS作为趋化因子的DMEM培养基，置37℃、5%CO₂中培养。24h后取出小室，用棉签擦去上室中未转移的细胞和多余液体。将小室用4%多聚甲醛中固定10min，然后用1%结晶紫染色30min。去离子水充分洗膜。显微镜下观察并计数。每组细胞设三个副孔，取平均值。

7. 细胞克隆实验：用胰酶消化Panc-1细胞，吹打制成单细胞悬液，接种于6孔板，约200个/孔，设为不加CPG组和浓度分别为1μg/ml、10μg/ml的CPG组，每组细胞设2个复孔。将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14 d。肉眼见到可见细胞克隆体后终止培养，去除培养液，PBS洗涤，苏木素染色30 min，PBS洗涤，计数细胞克隆形成率，数码照相照相。实验重复3次。

8. 统计学分析：实验数据经SPSS13.0软件分析，所有数据用平均数±标准差表示，对各组实验数据之间差异是否有统计学意义进行t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1．  TLR9蛋白在Panc-1中的表达：免疫细胞荧光检测TLR9在Panc-1细胞中的高表达，在紫外光激发下，细胞浆发出绿色荧光，而对照组没有发现荧光。（见图1）

2．  TLR9蛋白在胰腺癌组织中的表达：免疫组化结果显示，TLR9蛋白主要表达于癌细胞的胞浆内，呈棕黄色或棕褐色，染色均一；癌旁组织及正常胰腺组织的胞浆中也可见到TLR9蛋白表达，但呈浅黄色且较胰腺癌组织少。胰腺癌组织中TLR9蛋白总的阳性率为73.3％（22/30），而癌旁胰腺组织中和正常胰腺组织中TLR9蛋白阳性率为33.3％(10/30)、20％(2/10)。各组之间差异有显著性统计学意义(c2=13.99，P<0.01)。（见图2）

3．  MTT法检测CPG ODN2216对胰腺癌细胞Panc-1增殖的影响：不同浓度(0.1μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml)的CPG ODN2216对细胞株Panc-1有抑制作用，生长抑制率随着浓度增加及时间延长而明显增加。绘制生长抑制曲线，24、48、72 h的IC50为65.1μg/ml、16.43μg/ml、4.47μg/ml。抑制作用呈时间剂量依赖性(图3)。

4．  细胞划痕实验结果：实验结果显示，与对照组细胞相比，加入CPG ODN2216后Panc-1细胞迁移能力减弱，而且随浓度升高迁移能力减弱明显，有统计学意义(表1，图4)。

5．  CPG ODN2216对胰腺癌Panc-1细胞粘附力及体外侵袭能力的影响：CPG ODN 1μg/ml组, 10μg/ml组黏附抑制率分别为12.5％、22.5％，细胞黏附力明显低于对照组(t=25.4、14.9，均P<0.01)，抑制作用呈剂量依赖性(t=6.32，P<0.01)。侵袭能力比较对照组Panc-1细胞穿过膜较多，侵袭能力较强，CPG ODN2216浓度越高，穿过膜细胞数越少，侵袭抑制率分别为21.6％、59.5％(t=6.59、13.79,均P<0.01)，并呈剂量效应关系(t=18.29，P<0.01，表2，图5)。

6．  细胞克隆集落形成情况：10μg/ml CPG ODN2216实验组苏木素染色细胞克隆计数结果示，单位面积内(cm2)(0.27±0.13)个细胞的克隆数明显少于1μg/ml组(1.08±0.11)和对照组(1.17±0.12)。其与1μg/ml 组及对照组具有统计学差异（t=8.29、8.67，均P <0.01）。1μg/ml实验组与对照组两组间的细胞克隆数目差异不具有统计学意义(P>0.05)。(见图6)

讨 论

胰腺癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其恶性程度高，发病隐匿，对现有治疗手段疗效不佳，预后极差。流行病学调查资料显示近些年来全球范围胰腺癌发病率、死亡率均在上升^[4]，目前我国胰腺癌死亡率已由癌症死亡率的第16位上升到第6位。因此，寻找胰腺癌的基因治疗靶点，一直是胰腺癌研究领域中的热点。诸多的研究结果表明，由TLRs包括TLR9诱导的信号通路可能在肿瘤形成过程中起着重要作用，TLRs表达的上调与胃癌、肠癌、肺癌等发生、发展可能有密切关系^[5]。同时研究还发现TLR9在肿瘤上的表达可为肿瘤的化疗、免疫治疗提供新方法。本研究中，我们首先应用免疫组化方法，对胰腺癌组织切片中TLR9基因表达情况进行了检测，发现胰腺癌组织中TLR9基因的表达显著升高，并和癌旁胰腺组织及正常胰腺组织进行对比，发现胰腺癌组织、癌旁胰腺组织及正常组织中均有TLR9的表达，但癌组织的表达最高，显著高于非癌组织。这与Droemann^[6]在肺癌中的研究呈正相关结果一致。尔后，我们应用免疫细胞荧光化学技术检测了胰腺癌细胞中TLR9基因的表达情况，结果显示，TLR9蛋白在胰腺癌细胞Panc-1中为高表达，主要在细胞胞浆中表达。为了研究TLR9基因在胰腺癌细胞中高表达的意义，明确其作用及功能，我们应用TLR9的特异性配体CPG ODN2216与胰腺癌细胞Panc-1结合反应，从而研究CPG ODN对TLR9基因在人胰腺癌细胞生长、增殖等方面的作用与功能。

近年大量研究证实，CpG ODN具有很强的Th1方向的免疫凋节作用，主要是通过与TLR9结合，诱导分泌IFN-7、IL-12等Th1极性的细胞因子，促进Th0细胞向Th1方向分化。如CpG DNA通过序列非依赖性受体介导的内吞作用进入树突细胞，在溶酶体区域与TLR9特异性作用，然后通过IRAK1、IRF7、TRAF6、MAPK、核因子-KB(NF-KB)途径及衔接子MyD88激活下游信号通路^[7]。而目前CpG ODN作为免疫佐剂通过TLR9诱导强的Th1型免疫应答在人肺腺癌A549细胞上，可能作为单一治疗或者免疫治疗的辅助治疗应用于肿瘤的治疗^[8]。对于CPG ODN直接与胰腺癌细胞的作用效果，文献上未见报道。我们将CPG ODN2216直接与胰腺癌细胞Panc-1反应，采用MTT法检测，体外培养的胰腺癌细胞的生长、增殖被抑制达，并且抑制作用呈时间剂量依赖性。

恶性肿瘤的一个重要生物学特征是对邻近组织的侵袭及远处转移。侵袭是转移的基础和前提，转移是侵袭的延续和发展，两者是同一过程的两个阶段，胰腺癌较早就出现邻近组织的侵袭及转移，只有阻止胰腺癌的侵袭与转移，才能从根本上战胜胰腺癌。和其他肿瘤一样，胰腺癌的侵袭与转移是多基因参与的、多步骤、多阶段的过程 ^[9]。同时，粘附和侵袭的过程增加恶性肿瘤生存和转移的能力，在肿瘤的转移过程中是关键步骤^[10]。为进一步研究TLR9基因在肿瘤细胞侵袭、转移过程中的作用，我们运用TLR9特异性配体CPG ODN2216与胰腺癌细胞Panc-1进行了细胞划痕实验、粘附实验、Transwell体外侵袭实验和细胞克隆实验。划痕实验是测定细胞迁移能力的经典方法之一；粘附及侵袭实验可在体外环境中较理想地模拟并反映肿瘤细胞的侵袭行为和能力；细胞克隆实验可测定癌细胞成团增殖能力。实验结果表明，CPG ODN2216的使用引起Panc-1细胞的体外迁移和穿膜能力及克隆增殖能力较对照组细胞出现了明显的减弱；因此，以上结果表明TLR9的表达可以影响人胰腺癌细胞株的恶性程度。

综上所述，TLR9在胰腺癌组织及Panc-1细胞系均有高表达，TLR9可能通过增加细胞的侵袭、转移及粘附能力促进胰腺肿瘤的发生发展，在胰腺癌的浸润转移中起重要作用，但是该基因通过什么途径，何种方式调节细胞的运动与侵袭，其配体CPG ODN是通过何种传导系统影响到TLR9，目前尚不清楚，其具体机制还有待进一步研究。

参考文献

1. Jurk M, Vollmer J. Therapeutic Applications of Synthetic CpG Oligodeoxynucleotides as TLR9 Agonists for Immune Modulation. BioDrugs,2007;21(6):387-401.

2. Theiner G, Rossner S, Dalpke A, et al.TLR9 cooperates with TLR4 to increase IL-12 release by murine dendritic cells. Molecular Immunology,2008;45(1):244-252.

3. 司徒镇强，吴军正．细胞培养．西安：世界图书出版公司，2005：200-201．

4. Lowenfels AB，Maisonneuve P．Epidemioiogy and prevention of pancreatic cancer．Jpn J Clin Oncol，2004，34：238-244

5. Coussens LM , Werb Z. Inflammation and cancer . Nature , 2002; 420: 860-867.

6. Droemann D, Albrecht D, Gerdes J ,et al. Human lung cancer cells express functionally active Toll-like receptor 9. Respir Res,2005,6:1-10.

7. Underhill DM. Toll - like receptors: networking for success. Eur J Immunol , 2003 ,33 :1767.

8. Krieg AM. Toll-like receptor 9 (TLR9) agonists in the treatment of cancer. Oncogene, 2008; 27:161-167.

9. Celetti A，Testa D，Staibano S, et a1．Overexpression of the cytokine

osteopontin identifies aggressive laryngeal squamous cell carcinomas and enhances carcinoma cell proliferation and invasiveness．Clin Cancer Res．2005．1l：8019-8027．

10. Eble JA，Haier J．Integrins in cancer treatment．Curr Cancer Drug Targets，2006，6：89-105．

图1 免疫荧光染色显示TLR9主要表达在Panc-1细胞胞浆中（×200）

图2 TLR9蛋白在胰腺癌组织、癌旁胰腺组织及正常胰腺组织中的表达（×200）；胰腺癌组织（A），癌旁胰腺组织（B），正常胰腺组织（C）

图3  CPG ODN2216对胰腺癌细胞株Panc-1增殖的影响

表1 各组Panc-1细胞不同时间点划痕的宽度(
                 
                ±S)

时间（h）

对照组（mm）

1μg/ml组（mm）

10μg/ml组（mm）

0h

23.98±1.71

24.02±1.67

22.52±1.43

48h

13.27±1.11a

17.37±0.70a

20.20±1.06a

    注：Pa与对照组相比，P<0.01

图4  0h，48h各组Panc-1细胞划痕实验（×400）

表2 不同组别PANC-1细胞的运动、粘附、侵袭力(
                 
                ±S)

组别

n

细胞粘附抑制率（%）

侵袭细胞数

对照组

3

0

198±13

1μg/ml

3

12.5±0.85

144±5a

10μg/ml

3

22.5±2.62b

80±6b

注：与对照组比较，Pa< 0.01；与对照组及1μg/ml 组比较Pb<0.01

图5小室测定Panc-1细胞侵袭力×200  A. 对照组较多Panc-1细胞穿过滤膜；B. CPG ODN 1μg/ml组过膜Panc-1细胞显著减少；C.CPG ODN 10μg/ml组过膜Panc-1细胞进一步减少