耐药性癫痫耐药机制研究进展

癫痫是神经系统常见、多发病症。在过去20年中，有多个新型抗癫痫药物（AEDs）问世并应用于临床，但仍有1/3的癫痫患者不能得到滿意控制，药物治疗效果不良，称为顽固性或耐药性癫痫(intractable epilepsy, refractory epilepsy, drug-resistant epilepsy, medically refractory epilepsy)。耐药性癫痫具有很大的致残性,对患者生活质量及社会功能影响很大，是目前社会面临的一个重要医疗问题。

为进一步提高癫痫药物治疗效果，必须弄清耐药性癫痫耐药现象的细胞分子生学机制，以研发能够克服或逃逸耐药机制的新型抗癫痫药物。近几年来，有关耐药性癫痫耐药机制的研究开始得到重视，本文仅就这方面的研究作一综述。

1．耐药癫痫模型的建立 根据研究对象而言，对癫痫耐药现象及其机制的研究包括以下几个方面：（1）耐药性癫痫患者：从临床角度而言，耐药性癫痫并无一个明确统一的概念，一般对耐药性癫痫这样进行限定：在血药浓度监测指导下，经正规抗癫痫药物治疗效果不佳。但可为正归治疗、试验多少药物及多长时间并不明确。但多数有经验的癫痫科医师清楚如果患者历经数年的反复药物试验性治疗，如对常用一线抗癫痫药物如苯妥英钠、卡马西平及丙戊酸钠不敏感，基本上其它药物治疗效果也不佳。所以有学者认为对癫痫的耐药性的确立不宜无限制的进行药物试验性治疗，如采用足量苯妥英钠、卡马西平及丙戊酸钠治疗效果不良，即可确定为耐药性癫痫^（1）。在耐药性癫痫中有半数以上适合外科手术治疗，为可外科治疗的癫痫综合征（surgically remediable epileptic syndrome），如与脑局灶性病变相关的癫痫、与海马硬化相关的颞叶内侧癫痫等，这些患者可采用切除性手术（resective sugery）^（1）。手术标本可用于进行有关癫痫耐药的细胞及分子机制方面的研究。（2）耐药癫痫动物模型：建立电刺激杏仁核点燃大鼠癫痫模型或戊四氮点燃大鼠癫痫模型，后给予抗癫痫药物如苯妥英钠及苯巴比妥等进行筛选建立耐药性癫痫动物模型，以此研究耐药性癫痫耐药机制^{（2，3，4）}。(3).体外神经元培养，观察培养基中加用抗癫痫药物后神经细胞在分子水平上的变化，可以用以研究诸如离子通道对抗癫痫药物的适应性改变等。

2．耐药性癫痫耐药的可能机制：目前有关耐药性癫痫耐药的分子机制尚不清楚，可能为：（1）AEDs的作用靶点如钠通道或GABA受体消失或改变，神经细胞对AEDs不敏感；（2）由于血脑屏障上药物转体等的变化，药物进入脑实质细胞外液量减少，这样可能血药浓度在治疗范围，但脑细胞外液中浓度不够而达不到治疗作用；（3）神经细胞膜上药物转运体的改变，致使细胞内液中药物量不足，药物不能有效通过细胞内机制发挥抗癫痫作用。

3．耐药性癫痫与多药耐药基因及其表达产物P-糖蛋白：目前已有研究显示多药耐药基因（MDR1）表达上调，其表达产物（p-gp）增多与顽固性癫痫耐药现象有关。

MDR1基因，又称为ABCB1基因，是一大基因（209kb），其编码产物为p-糖蛋白170（p-gp170）。P-gp170为一跨膜ATP依赖性分子泵，在肠、胎盘、血脑屏障、肾及肝等组织中表达活跃，其主要生理功能与细胞分泌和出胞作用有关。已知p-gp170中介很多底物的出胞过程，这些底物包括50多种常用药物，如免疫抑制剂、羊地黄糖苷类强心剂、蛋白酶抑剂、β-受体阻滞剂等^（5）。大多数AEDs为亲脂剂，从理论上讲，应该是p-gp170的底物。有研究显示p -gp170至少卡马西平、苯妥英、丙戊酸等转运有关^（6）。另外癫痫的耐药性往往不具有药物选择性，一般同时对多种药物耐药，也提示耐药机制与药物转运有关。有关顽固性癫痫耐药现象与MDR1表达上调之间关系的研究主要包括以下几个方面。

（1）.癫痫动物模型研究显示癫痫发作可引起脑MDR1表达上调 实验动物主要为啮齿类动物，包括Wistar大鼠、SD大鼠等。癫痫模型有声刺激癫痫模型、电刺激癫痫模型、使君子药物诱导模型及点燃模型等。主要采用Northern印迹杂交法、Western印迹杂交法、PCR法及免疫细胞化学法等测定血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经元中MDR1基因表达情况。在啮齿类动物，MDR1基因有两个同型体：MDR1a和MDR1b。Kwan ⁽⁷⁾ 等对基因性癫痫易感大鼠（genetically epilepsy-prone rat, GEPR）进行研究，单次声源性发作（a single audiogenic seizure）后4h,24h和7天处死大鼠，采用RT-PCR测定大脑皮层、中脑、桥脑/延髓、海马中MDR1 a和MDR1b的表达，发现与对照组相比，在24时皮层和中脑MDR1a 表达增多，在7天时皮层MDR1a表达仍高，但在桥脑/延髓和海马中MDR1a无明显变化。MDR1b只在海马中有表达，且不受癫痫活动的影响。 Lazarowski ⁽⁸⁾ 等利用3-巯基丙酸（3-mercaptopropionic acid, MP）诱导Wistar大鼠癫痫模型进行研究，腹腔注射MP 45mg/kg 4天或7天后处死大鼠，用免疫组化法测定脑p-gp-170含量，发现海马、纹状体和大脑皮层中些毛细血管内皮细胞、胶质细胞和神经元中有p-gp-170免疫染色，说明MP诱导的癫痫发作可引起MDR1基因的区域和细胞性选择性表达。Van Vliet^（9）等利用电刺激诱导大鼠颞叶癫痫模型研究电刺激左侧颞叶诱导大鼠癫痫持续状态后MDR1a和MDR1b在右颞叶的表达情况，采用实时PCR测定发现MDR1b在颞叶中含量增多，在齿状回中这种增高具有可逆性而在海马旁回皮层中这种增多呈持续性，MDR1b上调与自发性癫痫发作有关，如大鼠在电刺激后没有自发性癫痫出现，则无MDR1b上调，MDR1a只在齿状回中有短暂上调。P-gp免疫染色在内皮细胞和胶质细胞中增强。

（2）.对顽固性癫痫患者手术切除病理致痫灶的研究 有相当部分顽固性癫痫，尤其与脑部一些病变相关的局灶性癫痫综合征可以采用手术切除致痫灶的方法来治疗，这为从临床角度研究MDR1基因表达状态与耐药现象间的相关性提供了可能性。结节性硬化是一常 染色体显性遗传综合征，可累及多个系统，但主要影响脑、皮肤和肾。在脑部可有多个灰质异位结节。其最突出的临床表现是顽固性癫痫发作，致痫灶一般在结节中。Lazarowski^(10,11)等先后报告3例结节性硬化合并顽固性癫痫采用手术取出脑部结节治疗癫痫发作，对所取标本采用免疫组化法观察结节中MDR1基因或多药耐药相关蛋白（MRP-1）表达性况，发现在异常的球形膨胀细胞、发育不良的神经元、星形细胞、微胶质细胞及一些内皮细胞中MDR1和MRP-1免疫染色强阳性。局灶性皮质发育不良（FCD）和神经元性胶质瘤（GG）是引起可手术治疗的顽固性癫痫发作的两个主要病理类型。Aronica ^（12）等对15例FCD和15例GG患者手术切除标本进行研究，所有患者均有顽固性癫痫，以非脑瘤无癫痫的尸解脑标本作对照。发现在对照组，p-g p不能测到，MRP-1仅在血管中发现有表达；在11/15例FCD的发育不良性神经元中和14/15例GG的神经元成分中可见MRP-1和p-gp表达，病灶内星形细胞及血管内皮细胞也可见ＭＲＰ－１和p-gp表达增多，而相对于正常脑组织而言，病灶周围脑组织中神经元及血管内皮细胞中上述两成分表达无明显增加。

（3）.MDR1基因多态性与顽固性癫痫耐药现象相关性的研究 临床工作中常会发现患同一类型癫痫，有的患者对AEDs敏感，有的患者则耐药。基于以上研究，这可能与基因多态性有关。Siddiqui^（13） 等对315例癫痫患者进行研究，其中115例对药物治疗敏感，200例为耐药性顽固性癫痫，另有200例正常对照组。利用外周血标本观察ABCB1C3435T多态性，发现在耐药性癫痫患者，在ABCB1 3435，有CC基因型的机会较有TT基因型的机会多。

(4) .顽固性癫痫致痫灶MDR1表达上调与耐药间的关系^{（12,,113，14）}

目前已提出假说认为在顽固性癫痫时，ＭＤＲ１表达上调，致血管内皮细胞、星形细胞和神经元中p-gp增多。血管内皮细胞p-gp增多，使抗癫痫药物进入脑组织细胞外液量减少，星形细胞p-gp增多，促使脑组织细胞外液中抗癫痫药物转移至血液中，其结果是尽管血药浓度在治疗范围内，但脑组织细胞外液中药物浓度偏低。神经元中p-gp表达增多，使细胞内抗癫痫药浓度低。这样AEDs就不能有效作用于致痫灶内致痫性神经元，而使癫痫成为顽固性癫痫。所以开发p-gp抑制剂或从基因水平开发影响MDR1表达的药物可能会成为研制新型抗癫痫药物的一个重要方向.

4．耐药性癫痫与人谷胱甘肽硫转移移酶（glutathione-S-transferase， GST）：

GST为肿瘤耐药基因家族主要成员之一，至少有四型：α，μ，π和微粒体GST。这些亚型在对底物特异性、对抑制剂反应、组织/细胞分布、亚单位组成及抗原性组成方面均有差异。GST π分布于甲状腺、泌尿道、呼吸道、胃肠道、子宫及肝胆管上皮细胞内。在胃、肾、子宫、卵巢等腺癌组织及头颈部鳞癌细胞、黑色素瘤、间皮瘤、肺类癌和淋巴瘤中均存在，是子宫颈肿瘤的可靠标志。目前有关GST与耐药性癫痫耐药现象关系的研究主要是针对GST π。有学者采用基因芯片技术对耐苯妥英钠点燃鼠进行研究，发现在耐药性癫痫鼠中GST π表达增强，用神经元培养的方法发现抗癫痫药物妥泰能诱导GST π表达，对耐药性癫痫患者血中GST π进行测定也发现其表达较非耐药癫痫患者明显增强^（15,16），提示其可能参与了难治性癫痫耐药机制的形成。由于GST π的表达是可调控的，改善其表达可能引起难治性癫痫患者耐药能力的下降，从而改善难治性癫痫的治疗，这些研究结果还需要在难治性癫痫患者脑组织中得到证实。国内有学者集5家癫痫外科中心的手术切除标本共同54例，其中有40例脑叶标本及14例海马，采用免疫组化方法测定认为为耐药性癫痫臻痫脑组织中GST π含量，发现病例组神经元细胞膜和胞浆均有不同程度的着染，较对照组神经元GST π表达明显增强，病例组各部位间比较GST π表达无显著性差异^（16）。有研究发现耐药性癫痫患者脑组织中GST π表达与癫痫病程呈正相关关系，提示耐药性癫痫患者脑组织中GST π表达增强可能参与了耐药性癫痫的形成^（16）。生理学研究发现外来有毒物质进入体内后，除经1相代谢酶如细胞色素P-450酶代谢系统进行转化解毒外，另一重要的代谢除毒机制就是经II相代谢酶进行代谢，GST π是II相代谢酶的主要成分之一，也是种重要的催化剂，可通过催化亲电物质与还原型谷胱苷肽结合或将与亲脂细胞结合的毒药物，转化为亲水物质排出体外，在保护机体的同时，降低药物疗效，从而组成了一条重要的生理防线。抗癫痫药物均非体内固有，对人体来说，这些对疾病有重要作用的化学物质都是有害物质，进入体内后必然触发人体的防御系统，使细胞内还原型谷胱苷肽在增多的GST π的催化下与抗癫痫药物结合，通过一系列紧密相扣的步骤将其排出体外，保护细胞免受药物攻击，在保护机体的同时，降低其抗癫痫作用，从而诱发癫痫患者耐药机制的形成。GST π表达增强无明显脑区差别，且发现血中GST π表达也增强，提示GST π表达增强可能是癫痫或抗癫痫药物诱导的全身反应，且可能与机体对药物或毒物易感基因表达有关⁽¹⁷⁾。

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