胃癌的分子分型研究进展

摘自中华临床医师杂志

作者：刘静文 刘红利 张涛

【摘要】 胃癌是发病率及致死率较高的一种恶性肿瘤。胃癌的病理分型是以组织形态结构和细胞生物学特性为基础，不同类型的胃癌，其形态结构和生物学行为各异，流行病学和分子机制亦不同，以致现有的胃癌病理分型系统众多。以往常用的病理分型包括Borrmann分型、Lauren分型和WHO分型，已有的这些胃癌分型对临床指导意义有限。最新的研究对295例胃癌进行综合性分子分析，这是癌症基因组图谱（TCGA）计划工作的一部分，基于对所得数据的分析整合，提出了一种新的胃癌分子分型，将其分为四个亚型：EBV感染型；微卫星不稳定（MSI）型；基因组稳定（GS）型；染色体不稳定（CIN）型。该研究于2014年7 月23日在《nature》在线发表，新发现的胃癌分子分型有助于胃癌个体化治疗靶向药物的筛选。本文将对胃癌的分子分型研究展开综述。

【关键词】 胃肿瘤； 分子分型

一、背景

目前，全球每年新发胃癌 100 余万例，中国占42%，死亡70 余万例，中国占 35%。胃癌已成为世界第三大致死癌种，在中国和日本尤为高发[1]。以往常用的病理分型包括 Borrmann 分型、Lauren 分型和 WHO 分型，这几种分型均是在组织形态结构和细胞生物学特性的基础上进行。1923 年德国病理学家 Borrmann 提出一种胃癌大体形态分型方法，称为 Borrmann 分型。此分型主要根据癌瘤在黏膜面的形态特征和在胃壁内的浸润方式进行分类，将胃癌分为四型：Ⅰ型（结节型） ，Ⅱ型（溃疡局限型） ，Ⅲ型（浸润溃疡型），Ⅳ型（弥漫浸润型） ；Ⅳ型胃癌胃壁呈广泛增厚变硬，又称革囊胃。1965 年 Lauren 根据胃癌的组织结构和生物学行为，将胃癌分为肠型和弥漫型，后来称为 Lauren 分型[2]。WHO于 1979年提出以组织来源及其异型性为基础的国际分型，该系统将胃癌分为腺癌（乳头状腺癌、管状腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌） 、腺鳞癌、鳞状细胞癌、类癌、未分化癌和不能分类的癌。1990 年 WHO对胃癌组织分型进行修改，新的标准将胃癌分为上皮性肿瘤和类癌两类，上皮性肿瘤包括腺癌（乳头状腺癌、管状腺癌、低分化腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌）、鳞腺癌、未分化癌和不能分类癌。然而这些分型系统临床意义小，均不能对临床个体化治疗提供有效治疗靶点，这使我们迫切的需要寻找一种新的分子分型方法，为胃癌个体化治疗靶向药物的筛选提供依据。研究表明，大多数胃癌与感染因素有关，包括幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）[3]和 EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染[4]。少部分胃癌与 E-钙黏蛋白基因（CDH1）[5]或错配修复基因（Lynch syndrome）种系突变有关，少数错配修复缺陷胃癌不表达 CIMP（CpG island methylator ohenotype）中的 MLH1[6]。基于以上相关研究，已有人用基因表达谱或 DNA 序列来描述胃癌的分子特征，但尚未形成一个明确的分子分型系统。

2014年 7月23 日在《nature》在线发表的一篇论文引起研究人员的广泛关注。作为癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）计划工作的一部分，研究者收集了 295 例未接受过放化疗的原发性胃癌患者组织和血液标本，采用 6 种分子平台

对样本进行分析，包括：（1）成组体细胞拷贝数分析；（2）全外显子序列分析；（3）成组 DNA 甲基化程度分析；（4）mRNA 序列分析；（5）miRNA序列分析； （6）成组反相蛋白分析（reverse-phase protein array，RPPA） 。77%的样本均进行了以上 6种分子平台的检测，全部样本 DNA 进行了微卫星不稳定（microsatellite instable，MSI）检测，107例样本进行了低通量全基因组测序。通过大量检测结果计算，基于对所得数据的分析整合，提出了一种胃癌分子分型，将其分为四个亚型： （1）EBV 感

染型，其特征包括 PIK3CA 频发突变、DNA超甲基化和 JAK2、CD274 和 PDCD1LG2 扩增； （2）MSI型，其特征是高突变率，包括编码癌基因信号通路蛋白的激活性基因突变；（3）基因组稳定（genomically stable，GS）型，其特征包括多发生于组织学弥漫型中，有 RHOA 突变或 RHO 家族GTP 酶活化蛋白基因融合现象； （4）染色体不稳定（chromosomal instability，CIN）型，其具有标志性的异倍染色体和受体酪氨酸激酶 （Receptor Tyrosine Kinases，RTKs）原位扩增[7]。

二、EBV病毒阳性型

EBV 型约占 9%，好发于胃底和胃体，多见于男性[8]。研究分别采用 mRNA、miRNA、外显子和全基因组序列分析来证实 EBV 感染，得到了高度一致的结果。相反，仅检测到极少量 H.pylori 感染证据，这说明细菌感染在促进慢性胃病发展为癌的过程中所起作用不大。 检测非配对肿瘤样本 CpG甲基化水平显示，EBV 型有丰富的 CIMP[9]，这与之前的研究结果一致[10]。EBV-CIMP 和 MSI 相关胃- CIMP 中甲基化情况的不同反映了各亚组突变谱和基因表达的不同。EBV 型的 DNA 超甲基化水平比任何 TCGA 报道过的肿瘤都要高。EBV 型都有CDKN2A（p16INK4A）启动子超甲基化。CDKN2A是细胞周期依赖性激酶抑制基因，为一种重要的抑

癌基因，其启动子发生甲基化后会导致基因不表达，促进肿瘤发生。但该型缺乏 MSI 相关 CIPM的特征性 MLH1 启动子超甲基化[11]。

EBV 型中多有 PIK3CA 突变[12-13]，80% EBV型发生了非无义 PIK3CA 突变，且其突变位点非常弥散。相反，其他亚型中只有 3%～42%的 PIK3CA突变，且突变多集中于编码激酶的外显子 20 处。因此， 抑制 PI3K 可用来证实 EBV型的这一特征[7]，并有可能成为该型的治疗靶点。此外，EBV型多有ARID1A（55%）和 BCOR（23%）突变，缺乏多见于 CIN型的 TP53 突变。 ARID1A为一种抑癌基因，其突变与多种肿瘤（如卵巢癌、肝癌、胃癌和乳腺癌等）的发生相关。BCOR 编码一种抗凋亡蛋白，

在白血病和髓母细胞瘤中同样可见其突变[14-15]。

研究发现了一个新的频发扩增位点，位于染色体 9p24.1， 包括 JAK2、 CD274 和 PDCD1LG2 扩增，该扩增多发生于 EBV型[7]。JAK2 编码一种 RTK，是潜在的治疗靶点[16]。CD274 和 PDCD1LG2 分别编码免疫抑制蛋白 PD-L1 和 PD-L2， 并可能成为抗肿瘤免疫应答的治疗靶点。CD274 扩增与 EBV 阳性淋巴样肿瘤中有 PD-L1 高表达相一致[17-18]。以 上研究结果提示 PD-L1/2 拮抗剂和 JAK2 抑制剂可能对 EBV型治疗有益。 基于以上研究结果， PIK3CA高频突变提示PI3K抑制剂可能对 EBV 型有独特的疗效。ARID1A 和BCOR频发突变提示其编码蛋白拮抗剂均可能成为此型患者的新靶向治疗药物。此外，受体酪氨酸激酶 JAK2 和免疫抑制蛋白 PD-L1/2 的过表达提示JAK2 拮抗剂和以增强抗肿瘤免疫反应为靶点的PD-L1/2 拮抗剂也可能成为此型胃癌患者的治疗新选择。

三、MSI 型

MSI 型约占 22%，好发于胃窦或幽门，多见于女性（56%） ，初诊年龄偏高（中位年龄 72 岁） 。该型有 DNA超甲基化和高突变率。DNA超甲基化包括 MSI 相关胃型-CIMP 及特征性 MLH1 启动子的超甲基化，后者可导致 DNA 错配修复蛋白 MLH1沉默表达[7,19]。 由 于 DNA修复机制异常而导致DNA高突变率，包括多种能激活致癌信号蛋白的基因突变，如 PIK3CA、ERBB3、ERBB2 和EGFR 突变。虽然在 MSI 型结直肠癌中发现了 BRAF V600E 基因突变，并进一步研发出了相应的靶向药物，且在临床上已显示出良好的疗效[20]， 但在 MSI 型胃癌中并未发现该突变。此外，用 HotNet 分析 MSI 型的基因突变显示在Ⅰ类组织相容性复合物基因中有相同的改变，包括 B2M和 HLA-B 突变。在结直肠癌和黑色素瘤中，B2M 突变会导致Ⅰ类 HLA 复合物表达缺失[21]，以上说明这类突变可通过减少抗原呈递而导致肿瘤免疫逃逸。 据以上研究，MSI 型缺乏靶向基因扩增，但具有高频 DNA 突变率，未来的研究重点将在于从众多的基因突变中筛选出可靶向抑制肿瘤的特征性基因突变，并探索出相应的靶向治疗策略。

四、基因稳定（GS） 型

GS 型约占 20%，初诊年龄偏低（中位年龄 59岁），多属 Lauren 分型中的弥漫型（73%）。GS 型多有 CDH1突变（37%） 、RHOA突变或 RHO家族GTP酶活化蛋白基因融合现象 （CLDN18-ARHGAP融合）[7]。此前认为 CDH1 种系突变与遗传性弥漫型胃癌（hereditary diffuse gastric cancer，HDGC）密切相关[22]。但是，在基因种系分析中仅揭示了两种 CDH1 多态性，且都不为 HDGC 的病因。RHOA突变是 GS 型的特征性突变。当 RHOA 处于 GTP结合的活化态时，能通过多种效应因子（包括ROCK1、mDia 和 PKN）调节肌动-肌球蛋白依赖的细胞收缩和移动[23-24]， 并激活STAT3通路促进肿瘤发生[25-26]。当发生 RHOA 突变时，RHOA 与 ROCK1等效应因子相接触的两个邻近的氨基末端结构域会发生改变。RHOA的突变位点并不类似于癌基因突变发生在 RAS 家族 GTP 酶处。尽管有 1 例发生了密码子 17 突变，但我们并没有发现 G17V 的显性负突变，该显性负突变在 T 细胞恶性肿瘤中有发生[27-28]。RHOA 突变能改变 RHOA 的下游信号通路。RHOA Y42C 突变减弱了 PKN 的活化，但对mDia 或 ROCK1 无影响[29]。有 5 例样本发生了RHOA Y42 突变， 该突变正如 HRAS上的 Y40， Y40的基因发生突变能选择性的减弱 HRAS 对 RAF 的活化，而对其他 RAS 效应因子无影响[30]。以上均说明， RHOA 在细胞运动方面具有重要作用，RHOA的改变会导致肿瘤呈分散性生长并使细胞缺乏黏附性，这些均是弥漫型胃癌的标志。

对频发性结构基因改变的分析进一步显示了GS 型中 RHO通路的重要性，这些改变包括 2 例发生于染色体间的 CLDN18 和 ARHGAP26（GRAF）易位。ARHGAP26 是一种 GTP 酶活化蛋白（GTPase-activating protein， GAP） ， 能使 RHO GTP酶转化为GDP 态，加强细胞移动[31]。CLDN18 是细胞紧密连接结构的组成部分[32]。此外，还发现了9例CLDN18-ARHGAP26融合， 2例CLDN18-ARHGAP6（编码同源 GAP）融合现象。该类融合发生在CLDN18外显子5的终止密码子之前， 为有义融合，导 致 CLDN18 胞 质 部 分 羧 基 末 端 连 接 有ARHGAP26 或 ARHGAP6 大片段，该嵌合蛋白保有 ARHGAP26/6 羧基末端 GAP 结构域，潜在影响ARHGAP 对 RHOA 通路的调节作用。同时，该融合现象也影响了 CLDN18 介导的细胞黏附作用。CLDN18-ARHGAP 融合与 RHOA 突变不会同时出现，其在 GS 型中发生率共占 62%。以上研究结果开启了全新的研究视角，有望为这类致死性较高的胃癌亚型带来新的治疗选择。

五、染色体不稳定（CIN）型

CIN型约占 50%，多发生于胃食管交界处和贲门（65%） ，多属 Lauren 分型中的肠型。CIN 型多为染色体异倍体。更具临床意义的特征是，几乎所有 RTKs 都有基因扩增，其中许多已能被现有的或研发中的药物所阻断[7]。该型常伴有 EGFR 磷酸化水平升高，且抗血管生成作用明显，VEGFR2 抗体ramucirumab 对此型胃癌可显示抗肿瘤作用，其疗效可能与 VEGFA 基因扩增有关[33]。此外，细胞周期调节基因（CCNE1、CCND1 和 CDK6）频发扩增提示其可能成为抑制周期素依赖激酶的潜在治疗靶点[34]。

六、总结

在日益提倡癌症个体化治疗的时代，现有的胃癌组织病理学分型已难以适应临床诊疗的需要。基于对胃癌分子和基因层面的特征分析，通过对现有MSI 和 EBV 的检测以及最新的基因组分析法的使用，找到集中的突变和扩增基因集，进而对胃癌进行分子分型，提出了一个新的分子分型法将胃腺癌分为四型：EBV感染型、MSI 型、GS 型和 CIN型。该分型法是对组织病理分型有效补充。这些分子亚型显示出特有的基因组特征，从而对靶向治疗的选择和临床实验中胃癌患者的分组具有指导性的意义。此外，RHOA突变同样见于亚洲胃癌患者，这为今后中国胃癌分子分型研究带来希望。希望这些结果将有助于以探索特定类型患者治疗的临床实验的发展，并最终提高疾病的生存率。