紫杉醇脂质体的研究进展（《中国肿瘤》2008年第17卷第8期）

郭仁宏¹综述，王金万²审校

1 江苏省肿瘤医院肿瘤内科，南京 210009

2 中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤医院肿瘤研究所，北京100021

[摘要]：紫杉醇(Paclitaxel)已成为一类广谱抗肿瘤药物被人们所熟知。近年来大量关于其抗肿瘤活性、全身毒性反应及其理化性质的研究被报道。尽管其具有明显的抗肿瘤作用，但紫杉醇因其药物载体聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor EL）及无水乙醇带来的超敏反应，以及本身的低水溶性，使得紫杉醇的临床应用受到了限制。有研究者构建了一种能够代替Cremophor EL的载体脂质体，能够增加紫杉醇的水溶性，提高其理化稳定性。同时能够减少紫杉醇的固有毒性及副反应。本文就紫杉醇脂质体近年来的研究与进展作一综述。

关键词：紫杉醇；脂质体；

Research and development in liposome formulation of paclitaxel

[Abstract]: Paclitaxel has established itself as an important class of broad-spectrum antitumor drugs currently available to the oncologist. A great deal of research of its antitumor activity, systemic toxicity and physico-chemical property has been reported recently years. Despite its strong antitumor activity, paclitaxel has limited clinical applications due to its low aqueous solubility and hypersensitivity caused by Cremophor EL and ethanol which is the vehicle used in paclitaxel. In an attempt to develop a pharmaceutically acceptable formulation that could replace Cremophor EL, a paclitaxel incorporated liposome has been constructed to improve solubility and physicochemical stability, and at the same time, lowering the inherent toxicity and side effects of paclitaxel. This review complies the recent reported works on the research and development of liposome for paclitaxel.

[keywords]: paclitaxel; liposome

紫杉醇被发现有抗肿瘤药物作用，具有里程碑式的意义。1967年Wani和Wall从短叶红豆杉(Taxus brevifolia Nutt.)的树皮中提取的天然产物(paclitaxe)。20世纪60年代,美国国立癌症研究所(NCI)发现紫杉树皮的粗提物具有抗肿瘤作用。此后的大量研究证据使成为一种广谱抗肿瘤药物。

1971年Wani等^[1]获得了纯品并确证了其结构(图1),为复杂的二萜类化合物,具有带含氧四环的紫杉烷环及酯侧链,并证明是抗肿瘤作用的有效成分。在进行临床研究中,由于其固有的一些特性，如天然产物产量极低,结构复杂然以分离提取，不易合成，另外其不溶于水，导致给药困难，使得研究工作进展缓慢。1979年紫杉醇影响细胞微管稳定，干扰细胞分裂过程的特性被发现，使人们再次对其在临床的应用可能产生兴趣。1983年开始了一期临床试验^[2]。1992年美国食物药品管理局(FDA)批准上市,商品名为taxol,用于一线药物或序贯化疗失

败后的转移性卵巢癌。20世纪90年代后期被誉为肿瘤治疗的重大突破,成为最有效的广谱抗癌药之一。通过与细胞微管蛋白结合,促进微管聚合,抑制其解聚,使细胞有丝分裂受到阻断,从而抑制肿瘤生长^[3]。临床上主要治疗卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌,目前在治疗进展期及晚期胃癌方面被称之为第三代化疗新方案;另外对转移性食管癌、肝癌、鼻咽癌、晚期胃癌、前列腺癌、头颈部鳞癌及对顺铂、阿霉素耐药的癌细胞也有效。目前美国已经将列为一线的广谱抗肿瘤药物。

紫杉醇具有以下特点:相对分子质量大,为细胞毒性药物,能直接杀伤肿瘤细胞,经肝脏转化成非毒性药物,抗肿瘤作用与药物。尽管具有良好的抗肿瘤活性,但在水中的溶解度很小。文献^[4]报道,在甲醇、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)等有机溶剂中可溶,而在水中的溶解度<0.03mg/ml。低水溶性,给静脉给药带来很大困难。为解决这一难题,人们在注射剂中加入了表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL，CrEL)。目前在临床最为常用的Taxol(紫杉醇0.25ug/mL),由6mg/mL的紫杉醇混合于Cremophore EL及无水乙醇(1:1)媒介中。

聚氧乙烯蓖麻油紫杉醇

早期研究过程中，人们发现聚氧乙烯蓖麻油紫杉醇致急性超敏反应发生率非常高，这些反应包括呼吸窘迫，低血压，血管性水肿，全身性荨麻疹等。在毒性研究时，将Cremophor EL输入动物狗的体内，所观察的表现与上述反应极其相似，人们推测并证实这种反应与的药物载体Cremophor EL有关。Cremophor EL此前已经被广泛应用于疏水性药物溶解媒介，如丙泊酚，安定，环孢霉素等。

聚氧乙烯蓖麻油虽能增加的水溶性,使其更容易通过血液输送至全身。但Cremophor EL会导致组织胺的释放，引起多种不良反应,如严重的过敏反应(HSRs)、中毒性肾损害、以轴索变性及脱髓鞘病变为特征的神经毒性、心脏血管毒性等^{[5, 6]}。正是因为严重的过敏反应导致Taxol的临床试验被推迟，直到寻找到减轻这种过敏反应的方法，即在给药前进行必要的毒副作用预防。美国国家肿瘤研究中心推荐在使用Taxol前24小时给予抗变态反应的药物，如预先注射皮质醇类(如地塞米松)、苯海拉明和H₂受体拮抗剂(如西咪替丁、雷尼替丁)等。有研究显示，虽然预先应用糖皮质激素、组胺拮抗剂使得到相应的毒副作用得到控制与缓解，Taxol应用还是会带来多种毒副作用，其中包括TPX本身的毒副反应^[7]，这些反应有周围神经病变^[8]，心律失常，脱发，粘膜炎，疲劳^[9]，皮肤指甲毒性反应(指甲松离，皮炎，反应性红斑)^{[ 10]}。且皮肤充血及皮疹的发生率仍高达40％，其中3％的患者仍会产生威胁生命的严重过敏反应。值得注意的是在肿瘤化疗过程中，糖皮质激素如地塞米松的应用以及在体内的积累给肿瘤的治疗带来负面的影响。有研究尝试改变的溶剂为聚乙二醇，结果发现新的混合物下降了的抗肿瘤活性，因此Cremophor EL至今仍然作为紫杉醇的标准溶剂，后来有改进方法，即使用Cremophor EL与聚乙二醇的1：1的混合媒介体为载体。由于上述毒副反应，促使人们寻找一种提高或不影响治疗指数、降低毒性反应、消除副反应，有较高的靶向分布特性、工艺制作易控制的药物载体代替Cremophor EL非常重要。近年来脂质体作为一种药物的载体，被广泛应用于众多水溶性差的药物递送载体。其中不同类型的脂体成为研究热点。早在2003年江苏省药物研究所研制、南京振中生物工程有限公司开发出紫杉醇紫质体(力扑素)，在动物实验中证实，其与传统紫杉醇相比，具有良好的抗肿瘤效应及较低的毒副反应，目前有关力扑素的III期临床试验也有相继报道^{[11, 12]}。

脂质体：

脂质体(liposomes)最初作为一种生物膜的研究模型，到目前其已经成为一种定向药物载体。药物粉末或溶液包埋在直径为纳米级的脂质体微粒中，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性，提高患者耐受性等方面表现出了独特的优势。1996年前由美国FDA批准的阿霉素长循环脂质体(Doxil,Caelyx,都可喜)^{[ 13, 14]}。Doxil的研究成功,鼓舞了脂质体载药体系的研究与开发。

1965年英国学者Bangham和Standish^[15]将少量的磷脂混入水溶液中，他们在电镜下发现磷脂形成数量很多的球形类脂小体，这种磷脂分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的的封闭囊泡，称为脂质体。由于脂质体具有易于在生物体内降解、无毒性和无免疫原性等特点,目前已经广泛应用于细胞生物学、基因工程、药学等各个领域。脂质体药物是具有持效性和体内分布选择性的药物转运系统(DDS),主要是根据机体膜透过性、选择性的机制研制而成。

脂质体由一个或多个酷似细胞膜的脂质双分子层包裹着水相介质构成。脂质体双分子层以磷脂为主要成分,附加剂常有胆固醇、磷脂酸等,可以调节双分子层流动性及稳定性或改变脂质体表面电荷性质。磷脂为两性物质,在结构上有亲水及亲脂基团。构成双分子层的磷脂其亲水性的部分形成双分子层的内外表面,而亲脂性的尾端部分处于膜的中间。这种结构使其能携带各种亲水的、疏水的或两亲的物质。

脂质体的种类繁多，按结构和粒径，脂质体可分为单室脂质体、多室脂质体、含有表面活性剂的脂质体。按性能，脂质体可分为普通脂质体（包括上述单室脂质体、多室脂质体和多相脂质体等）和特殊性能脂质体，后者包括空间稳定脂质体(又称长循环脂质体)、糖基修饰脂质体、热敏脂质体、pH敏感脂质体、免疫脂质体、超声波敏感脂质体、光敏脂质体和磁性脂质体等。按荷电性，脂质体可分为中性脂质体、负电性脂质体、正电性脂质体。

生物体内因有丰富的磷脂，可为脂质体的制备提供材料：卵黄中的磷脂酰胆碱(卵磷脂，PC)、牛脑中的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇及神经鞘磷脂是最理想的制备材料。磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油等也可作为脂质材料。常应用多种材料的混合制备脂质体。在加入10%的硬脂胺、鲸腊醇磷酸酯等辅料时，还可以提高药物的包封率。

脂质体的制备

制备脂质体的方法很多,常用的有被动包封法和主动包封法；其中被动包封法有：薄膜分散法、逆相蒸发法、溶剂注入法、表面活性剂分散法、冻结熔融法、冷冻干燥法、复乳法。由被动包封法制得的脂质体通常包封率不高,且包封条件不易掌握。主动包封法从根本上改变了难以制备高包封率脂质体的局面。主动包封法最早指pH梯度法,在此基础上又发展了硫酸铵梯度法和醋酸钙梯度法。主动包封法利用两亲性的弱酸、弱碱药物能以电中性的形式跨越脂质双层,而其电离形式却不能跨越的原理,通过形成脂质体膜内、外水相的pH梯度差异,使脂质体外水相中的药物自发地向脂质体内部聚集。硫酸铵梯度法包封阿霉素(Doxil)是在pH梯度法的基础上根据化学平衡移动原理而设计的。

脂质体的改进

聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)衍生化磷脂

普通脂质体进入体内后很快被网状内皮系统(reticuloendothelial system,RES)摄取,导致其迅速从血液中清除并在RES相关的组织器官(如肝和脾)蓄积。针对这一问题,开发了长循环隐性脂质体。长循环隐性脂质体是表面含有聚合物修饰的类脂衍生物的新型脂质体。最常用的类脂衍生物是PEG与磷脂分子通过共价键结合形成的PEG衍生化磷脂,它可以阻止RES对脂质体的识别和摄取,延长其体内循环时间。对于脂质体而言,PEG衍生化磷脂还能提高脂质体的物理稳定性,延长有效期。这些修饰物通过增加粒子间的斥力防止粒子的聚集,形成“构象云”(conformational clouds)从而产生较大的空间位阻^{[16, 17]},并可在粒子表面形成水化膜,掩盖疏水性结合位点,降低RES相关蛋白对脂质体的识别和摄取^{[18, 19]}。最近一项研究表明，PEG衍生化磷脂存在一种特殊的加速血液清除现象，这不仅与其作为药载系统特性有关，与减轻蓄积降低药物毒性相关^[20]。

pH敏感性或温度敏感性脂质体

利用PEG衍生化磷脂可以制备pH敏感性或温度敏感性脂质体,从而达到对弱酸性或相对高温部位的靶向释药(如实体瘤和炎性部位)。Ishida等^[21]研究的阿霉素pH敏感性脂质体可在80%人血浆中孵育12h仍保持基本稳定,而在pH6.5～4.5的范围内则可迅速释出约90%的药物。

不同电性的PEG衍生化聚合物可制得负或正电性的脂质体,用于包封电性相反的药物,以提高药物包封率。1987年Felgner等^[22]首次报道使用阳离子脂质体包封核酸,应用于基因治疗领域。Merritt等^[23]应用包装有siRNA沉默IL-8基因的中性脂质体治疗卵巢癌病人，卵巢肿瘤的生长受到明显抑制。

脂质体靶向作用研究

脂质体在肿瘤治疗中本身有很好的被动靶向作用。Matsumura及Maeda^[24]首次提出了其作用机制为增强渗透与滞留(enhanced permeation and retention, EPR)效应。脂质体在输送至肿瘤部位的血管时，其可通过毛细血管上皮细胞间隙进入肿瘤组织,从而达到一定的肿瘤靶向作用。利用放射性标记法检测其体内分布有力证明了EPR效应^[25]。脂质体载药体系的被动靶向作用,在提高疗效的同时还可降低毒性,原因与其改变药物的体内分布有关。由于严重的心脏毒性,蒽环类抗癌药物的应用受到了限制,而利用包封脂质体的方法则可以在保留其抗肿瘤活性的同时降低其心脏毒性^[26]。

抗体介导的脂质体可使脂质体获得更好的靶向作用,从而大大减轻化疗药物对正常组织的损伤。常用的方法包括偶联抗体、抗体片断或低分子量配体制备免疫脂质体。在临床治疗与试验中,已证实偶联的单克隆抗体，如EGF mAbs，CD52 mAbs，anti-CD19等^{[27, 28]}与化疗药物联合用药可显著提高化疗效果,这是因为mAbs与肿瘤细胞结合后可以触发补体介导的及抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。这一研究结果显示,mAbs脂质体可能具有靶向性和协同细胞杀伤作用的双重优势。然而,mAbs免疫原性较强,容易激活人体免疫系统,使得mAbs脂质体的血浆清除率提高,并有可能引发过敏反应。此外,mAbs的分子量较大,不利于免疫脂质体穿过血管壁向实体瘤部位渗漏。一些研究者使用抗体片断(如Fab段)来替代完整的mAbs,降低免疫脂质体的免疫原性和抗体分子量,可有效延长该脂质体在血液中的循环时间,降低肝脏摄取量，从而降低药物在肝脏蓄积导致的肝毒性^[29]。然而,由于缺少Fc段将不会激活补体,无法产生补体介导的细胞毒作用。低分子量配体免疫原性较低、分子量小,有利于向肿瘤组织深部渗透,成为近年来研究的新趋向。Xiong等^[30]制备了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸类似物修饰的阿霉素立体稳定脂质体( arginine-glycine-asparticacid mimetic modified sterically stabilized liposomes, RGDm-SSL),体内药效学实验显示其抗肿瘤效果较普通阿霉素隐形脂质体更强,荧光共聚焦试验表明RGDm-SSL可以通过整合素介导的内吞作用促进黑色素瘤细胞对阿霉素的摄取。Yang T等^[31]制备的聚二乙醇免疫脂质体，发现这种脂质体对抗HER2 高表达的乳腺癌细胞具有较高的敏感性与特异性。

抗肿瘤领域应用的新思路还包括:将抗肿瘤药物与免疫增强剂包封于同一脂质体中发挥协同作用^[32];利用pH或温度敏感性的脂质体提高抗肿瘤效果^{[33, 34]};利用体外施加能量实现靶向释药,如短波红外线、磁场及光动力学等^[35]。

虽然近10年抗肿瘤药物的研发取得了较大进步,然而临床化疗的成功率却并未显著提高,导致化疗失败的一个重要原因是多药耐药(multidrug resistance, MDR)。针对这一问题,Li等^{[36, 37]}提出并构建了抗耐药脂质体:将化疗药物拓扑替康和耐药逆转剂氨氯地平同时包封于脂质体中,制得抗耐药隐形脂质体,结果表明,该抗耐药隐形脂质体能够逆转耐药细胞株MDR HL260 对化疗药物的耐药,并且对MDR HL-60诱导的肿瘤有较强的抑制作用;对其抗耐药机制的研究显示,氨氯地平可以逆转膜蛋白P-糖蛋白的过度表达从而抑制进入肿瘤细胞内的化疗药外排(efflux),同时,可导致肿瘤细胞内Ca²⁺浓度外流,诱导肿瘤细胞凋亡。

另外,脂质体在肿瘤诊断中的应用也取得了较大进展。人们若能在肿瘤发生的早期准确检测到肿瘤,将为治疗赢得宝贵的时间。而现在临床使用的检测手段普遍存在灵敏度低和差异较大的缺陷。最近的一些成功事例预示着脂质体和纳米粒将为肿瘤诊断带来新的策略。例如, 将明胶酶抑制性多肽CTT(CTTHW GFTLC)及放射性的⁹⁹-Tc同时结合到脂质体上,这种双重标记的脂质体可以灵敏地检测到肿瘤新生血管,包括一些常规方法检测不到的肺癌转移灶^[38]。

近年，Lee等应用受体靶向元件与脂质体载体联合，合成叶酸盐受体（FR）靶向的紫杉醇脂质体^[39-41]。这种复合物平均大小为97.1nm,包括紫杉醇:脂质的摩尔比率为1：33，能够在4℃稳定至少72小时。在人类FR-+KB口腔癌细胞珠阻断性实验中，这种复合物与非靶向脂质体紫杉醇相比，靶向活性提高了3.8倍。药物代谢动力学实验显示，靶向与非靶向脂质体紫杉醇的血清半衰期(t_1/2β)分别为12.3小时及14.2小时，而单独紫杉醇却只有1.8小时。

非靶向的脂质体目前仍在进行广泛的研究，Zhang等^[42]最近报到了一种三体系统，由紫杉醇，α生育酚琥珀酸，脂质类组成（如：磷酯酰胆碱，胆固醇，或心肌磷脂），其平均大小为150nm。这种三体药物动力学分析，包埋率超过90％，在25℃－28℃之间能够稳定超过12小时，在制备过程中，水中稀释到0.25mg/mL，水溶性不变的情况下分子大小不变。

克服生物屏障

生物屏障主要来自上皮细胞间的紧密连接,同时还有一些酶和载体参与,阻止药物透过生物膜到达治疗部位。脂质体在促进透皮吸收和消化道吸收等方面均有报道,然而最引人瞩目的为其在克服血脑屏障(blood brain barrier, BBB)方面的进展。BBB是许多中枢神经系统(central nervous system, CNS)疾病治疗的主要障碍,脂质体通过结合转铁蛋白受体、低分子量多肽或糖、联合光动力学或热敏体系都可以较好地克服BBB^{[43, 44]}。另外,结合一些新的给药方式,如增强传送递送系统(convection-enhanced delivery, CED )^{[ 45]},可以增强脂质体克服BBB的能力。

脂质体仍面临的问题：

脂质体的稳定性尚未得到完美的解决,导致产品的保质期较短;脂质体的工业生产成本相对偏高,致使其价格也十分昂贵，从而限制了它的推广。脂质体和纳米粒药物动力学的复杂性等问题尚待进一步的研究,包括其在RES的蓄积引起的肝脏毒性。通过不断对脂质体的表面修饰，使得脂质体的应用更为广泛。通过更进一步的研究与完善，相信脂质体以抗肿瘤药物递送系统的角色，将会对肿瘤的治疗具有令人鼓舞的前景。（《中国肿瘤》2008年第17卷第8期）

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